美洲大蠊水提取物對免疫性肝纖維化大鼠的保護作用

夏 超，王佳佳，李芳群，胡祥鵬，宋莎莎，章禮久

美洲大蠊水提取物對免疫性肝纖維化大鼠的保護作用

夏 超1，王佳佳2，李芳群1，胡祥鵬1，宋莎莎1，章禮久1

目的研究美洲大蠊水提取物對免疫性肝纖維化大鼠的保護作用及部分機制。方法將 SD大鼠隨機分為正常組、模型組 、美 洲 大蠊 30 mg／kg、60 mg／kg和 120 mg／kg組和秋水仙堿物組，每組 10只。免疫性肝纖維化模型通過大鼠腹腔注射豬血清制備，0.5ml／kg，每周 2次，共 12周。造模期間給藥組分別給予相應的受試藥物，正常組和模型組分別給予等劑量的生理鹽水。于造模給藥結束后處死大鼠，測定肝脾指數；收集外周血，測定血清中丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、透明質酸（HA）、層粘蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原酶（PCⅢ）和Ⅳ型膠原酶（CⅣ）含量；取肝臟，HE、Masson染色觀察肝組織病理及膠原沉積變化；制備肝臟勻漿，ELISA法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）、谷光甘肽過氧化物酶（GSH-Px）含量；免疫組織化學和 Western blot法測定肝組織中 α-SMA、TGF-β1蛋白的表達。結果與模型組比較，美洲大蠊（30、60、120 mg／kg）能降低肝纖維化大鼠升高的肝脾指數，降低血清中 ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平，降低肝組織 MDA含量，提高SOD及 GSH活性，減輕大鼠肝臟病理損傷程度，減少肝組織中 α-SMA、TGF-β1的表達。結論美洲大蠊水提取物對豬血清誘導的免疫性肝纖維化大鼠有顯著的保護作用，其機制可能與其抗氧化作用及抑制 TGF-β1的表達有關。

美洲大蠊水提取物；免疫性肝纖維化；豬血清；抗氧化；轉化生長因子 β1

肝纖維化是肝臟對各種慢性刺激進行損傷修復時的病理改變，主要表現為肝內細胞外基質的過度沉積。肝纖維化是肝硬化的前期過程，其病理過程的可逆性為延緩慢性肝病發展為肝硬化提供了可能。美洲大蠊為蜚蠊科昆蟲，俗稱蜚蠊，又稱蟑螂、偷油郎等，是一種十分古老的昆蟲。其入藥始載于《神農本草經》，并將其列為中品，味咸、寒，治血瘀堅、寒熱、破積聚、喉咽痹、內寒無子［1］。近年來美洲大蠊的藥用價值得到了人們廣泛關注。美洲大蠊的不同提取物對大鼠急性免疫性肝損傷均有一定的保護作用［2］，但對大鼠免疫性肝纖維化是否有作用尚不清楚。該實驗采用豬血清誘導大鼠免疫性肝纖維化模型，研究美洲大蠊水提取物對其的治療作用及初步機制探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性 SD大鼠 50只，（200±20）g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 藥品與試劑美洲大蠊購自云南騰沖坤發生物養殖有限公司，經安徽醫科大學藥理學實驗室鑒定為美洲大蠊干燥蟲體。將蟲體研磨成粉，干燥通風保留，實驗室先前的方法［2］獲得水提取物：稱取干燥蟲粉 500 g，以 5倍量石油醚超聲脫脂 2次，每次 30 min，旋轉蒸發干燥，回收石油醚；用 15倍量的蒸餾水分 3次超聲提取，每次 30 min；提取液合并濃縮干燥，得美洲大蠊水提取物。秋水仙堿購自西雙版納藥業有限公司。豬血清，取新鮮豬血清離心過濾除菌自制。谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase， 2015-11-17接收ALT）、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽 -過 氧 化 物 酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、透明質酸 （hyaluronic acid，HA）、層粘蛋白（laminin，LN）、Ⅲ型前膠原酶（procollagenⅢ，PCⅢ）、Ⅳ 型膠原 酶 （collagenaseⅣ，CⅣ）測定試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司。小鼠源抗轉移生長因子-β1（transforming growth factor beta1，TGF-β1）單克隆抗體、小鼠源抗 α-SMA單克隆抗體、小鼠源抗 β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的 IgG二抗均購自北京博奧森生物技術有限公司。SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 造模及給藥SD大鼠適應性飼養 1周后隨機分為正常組、模型組，美洲大蠊水提取物 120 mg／kg、60 mg／kg、30 mg／kg劑量組、秋水仙堿（0.1 mg／kg）組陽性藥物對照。除正常組外，其余各組每周 2次腹腔注射豬血清 0.5 ml，共 12周。從造模第一天起給藥組開始灌胃給藥直至造模結束，正常組和模型組給予等量的生理鹽水。期間大鼠自由進食與飲水，末次灌胃后禁食8 h后處死大鼠，取血標本及肝脾組織備檢。

1.4 肝脾指數測定大鼠稱重后采用 10%水合氯醛麻醉后處死，分別摘取肝臟和脾臟，PBS洗凈后稱重，計算肝臟指數和脾臟指數。

1.5 血清ALT、AST、纖維化指標及肝組織中MDA、GSH-Px和SOD含量測定大鼠采用 10%水合氯醛麻醉后腹主動脈取血，室溫靜置 30 min后2 500 r／min離心 15 min，取上層血清，按照試劑盒要求測定血清中 ALT、AST含量；同時采用 ELISA法測定血清中 HA、LN、PCⅢ、CⅣ的水平。取大鼠右葉稱重，使用勻漿機打碎，冰浴中制備 10%肝臟勻漿，3 000 r／min離心 10 min后取上清液，按試劑盒說明書測定肝勻漿中 MDA、SOD和 GSH-Px含量。

1.6 肝組織病理學檢查取大鼠肝臟左葉組織，10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，制作 4μm切片，常規脫蠟，按常規方法行 HE和 Masson染色，光鏡下觀察肝臟組織病理改變、拍照。

1.7 免疫組化法測定肝臟組織α-SMA、TGF-β1的表達肝組織切片常規脫蠟水化經微波法抗原修復，其他步驟按超敏 SP試劑盒說明書操作，一抗分別為抗 α-SMA和抗 TGF-β1，二抗為鼠兔通用型二抗。光鏡下觀察肝組織中 α-SMA和 TGF-β1的表達情況。并采用 Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對各免疫組化圖片進行表達量和表達強度的分析。

1.8 W estern blot法分析肝組織α-SMA和TGF-β1的表達取各肝臟勻漿，用總蛋白裂解液提取肝臟總蛋白，BCA法進行蛋白定量。電泳并濕轉PVDF膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h，用 PBS洗3次，10 min／次。分別加入 α-SMA、TGF-β1和 β-actin抗體，在 4℃條件下孵育過夜。PBS洗 3次，10 min／次。用 HRP標記的二抗室溫下孵育 2 h，PBS洗 3次。加 ECL化學發光劑，用天能 4500化學發光成像系統進行顯影。采用 Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對實驗結果進行分析，結果以目標條帶與 βactin條帶的比值表示。

1.9 統計學處理采用 SPSS 17.0統計軟件進行分析，實驗數據以 ˉx±s表示。多組計量資料分析采用 OneWay ANOVA，多重比較采用 LSD。

2 結果

2.1 美洲大蠊水提取物對肝纖維化大鼠肝脾指數的影響與正常組比較，模型組大鼠的肝脾指數明顯升高（P＜0.05），提示造模成功。與模型組比較，美洲大蠊水提取物 30 mg／kg、60 mg／kg、120 mg／kg組及秋水仙堿組肝脾指數顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

2.2 美洲大蠊水提取物對肝纖維化大鼠肝功能的影響由下表可知模型組大鼠血清 ALT、AST水平較正常組明顯升高（P＜0.01），提示造模成功。美洲大蠊水提取物各劑量組及秋水仙堿陽性藥組ALT、AST水 平 明 顯 低 于 模 型 組 （P＜0.05，P＜0.01）。見表 1。低，MDA含量升高（P＜0.01）。與模型組相比，美洲大蠊水提取物組及秋水仙堿組 SOD、GSH-Px升

圖1 美洲大蠊水提取物對肝纖維化大鼠肝脾指數的影響A：對大鼠肝臟指數的影響；B：對大鼠脾臟指數的影響；1：正常組；2：模型組；3：美洲大蠊 30 mg／kg組；4：美洲大蠊 60 mg／kg組；5：美洲大蠊 120 mg／kg組；6：秋水仙堿組；與正常組比較：＃P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05

2.3 美洲大蠊水提取物對肝纖維化大鼠肝組織SOD、MDA和GSH-Px水平的影響與正常組比較，模型組大鼠肝組織中 SOD、GSH-Px水平明顯降高，MDA降低（P＜0．05，P＜0.01），提示美洲大蠊水提取物在一定程度上有抗脂質過氧化、減輕肝損傷的作用。見表2。

2.4 美洲大蠊水提取物對肝纖維化大鼠纖維化指標的影響模型組大鼠血清的肝纖維化指標 HA、LN、PCⅢ、CⅣ較正常組明顯升高（P＜0.01）。美洲大蠊水提取物顯著降低了模型組升高的肝纖維化指標（P＜0.05，P＜0.01），提示美洲大蠊水提取物有降低肝纖維化程度的作用。見表3。

2.5 美洲大蠊水提取物對肝纖維化大鼠肝組織病理學的影響

2.5.1HE染色 HE染色后光鏡下觀察可見模型組肝索排列紊亂，肝細胞腫脹、胞質疏松，伴有部分細胞壞死和炎性細胞浸潤。美洲大蠊水提取物各劑量組和秋水仙堿組肝索基本呈放射狀排布，部分細胞腫脹，可見少量細胞壞死、炎細胞浸潤，與模型組比較有顯著改善。見圖1。

2.5.2Masson染色 正常組未見明顯藍色纖維，僅少量分布于血管周圍。模型組肝組織中纖維明顯增多，肝小葉結構被破壞，大量纖維化組織條索狀分割肝組織。美洲大蠊水提取物及秋水仙堿組纖維化組織均不同程度的改善或僅有少量藍色纖維。見圖2。

2.6 美洲大蠊水提取物對肝纖維化大鼠肝組織α-SMA、TGF-β1表達的影響

2.6.1免疫組化結果 正常組僅血管壁有少量 α-SMA的表達，在細胞質無表達。模型組的匯管區及鄰近的肝竇有大量表達陽性的細胞，胞質呈棕黃色，著色明顯。與模型組相比，美洲大蠊水提取物各劑量組及秋水仙堿組陽性細胞數明顯減少，細胞質陽性染色顯著減輕。見圖3。此外，正常組未見 TGF-β1表達，模型組 TGF-β1主要分布于變性的肝細胞、間質細胞、纖維化區和匯管區，染色主要呈棕黃色。與模型組相比，美洲大蠊水提取物各劑量組及秋水仙堿組在以上區域陽性細胞數目減少，陽性染色程度減輕。見圖4。

2.6.2Western blot結果 檢測美洲大蠊水提取物對肝纖維化大鼠 α-SMA、TGF-β1表達的影響。結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織中 α-SMA、TGF-β1表達明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，美洲大蠊水提取物各劑量組 α-SMA、TGF-β1蛋白表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5。

表2 美洲大蠊水提取物對肝纖維化大鼠肝組織 SOD、MDA和 GSH-Px水平的影響（ˉx±s）

圖2 美洲大蠊水提取物對肝纖維化大鼠肝組織病理學的影響 ×2001：HE染色；2：Masson染色；A：正常組；B：模型組；C：美洲大蠊 30 mg／kg組；D：美洲大蠊 60 mg／kg組；E：美洲大蠊 120 mg／kg組；F：秋水仙堿組

圖3 美洲大蠊水提取物對肝纖維化大鼠 α-SMA表達的影響 SP免疫組化 ×200A：正常組；B：模型組；C：美洲大蠊 30 mg／kg組；D：美洲大蠊 60 mg／kg組；E：美洲大蠊 120 mg／kg組；F：秋水仙堿組；與正常組比較：＃＃P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

圖4 美洲大蠊水提取物對肝纖維化大鼠 TGF-β1表達的影響 SP免疫組化 ×200A：正常組；B：模型組；C：美洲大蠊 30 mg／kg組；D：美洲大蠊 60 mg／kg組；E：美洲大蠊 120 mg／kg組；F：秋水仙堿組；與正常組比較：＃＃P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

表3 美洲大蠊水提取物對肝纖維化大鼠纖維化指標的影響（ˉx±s）

圖5 美洲大蠊水提取物對肝纖維化大鼠肝組織α-SMA、TGF-β1表達的影響1：正常組；2：模型組；3：美洲大蠊 30 mg／kg組；4：美洲大蠊 60 mg／kg組；5：美洲大蠊 120 mg／kg組；6：秋水仙堿 組；與正常組比較：**P＜0.01；與模型組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

3 討論

肝纖維化是各種急慢性肝病共有的組織病理學基礎。目前普遍認為肝纖維化的病理過程是可逆的［3］。因此合適的肝纖維化模型對研究肝纖維化發生機制及保肝藥物的篩選尤為重要。本實驗采用豬血清誘導大鼠免疫性肝纖維化。豬血清作為異種血清在機體產生免疫復合物后發生一系列的反應表現為Ⅲ型變態反應，這與人類慢性乙型肝炎肝纖維化有一定相似性，對臨床的研究有非常大的價值［4］。

血清中 ALT、AST的水平是診斷肝臟疾病的重要指標，當肝臟出現細胞腫脹、壞死或肝實質性病變時 ALT、AST會顯著升高。本研究結果顯示，美洲大蠊水提物可顯著降低血清 ALT、AST水平，可以保護肝功能，一定程度上減輕肝臟損傷程度。肝纖維化是細胞外基質的過度增生和沉積引起的，血清 HA、 LN、PCⅢ、CⅣ可反應肝纖維化程度，并與病變程度呈正相關［5］。本研究結果顯示美洲大蠊水提取物可以降低血清 HA、LN、PCⅢ、CⅣ的含量，說明其可以改善大鼠肝纖維化作用。當肝細胞發生脂質過氧化反應時，MDA作為脂質過氧化反應的終產物可以一定程度上反映肝細胞過氧化后的損傷程度。SOD是機體內存在的超氧自由基清除因子，可以清除自由基和過氧化物，亦可作為衡量肝細胞受損的指標。GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，其對過氧化氫的還原反應從而保護細胞膜結構與功能的完整［6］。本研究表明美洲大蠊水提物能降低肝臟組織的 MDA水平和提高 SOD、GSHPx的水平，提示美洲大蠊水提取物能夠抑制肝臟組織脂質過氧化反應、保護抗氧化的作用，其對免疫性肝纖維化的治療作用可能與其抗氧化作用有關。

目前研究［7］顯示，肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）的活化、增殖和過度分泌在肝纖維化的發生、發展過程中起關鍵作用，因此抑制 HSC的活化、增殖和過度分泌成為阻止肝纖維化發生發展的一種重要手段。α-SMA是 HSC活化的主要標志物，其與 HSC的活化程度和數量呈正相關［8］。TGF-β1是致肝纖維化最有 效的細胞因 子 之 一［9］，其激 發HSC活化，促進細胞外基質產生、抑制基質的降解，是調 節 肝 纖 維 化 發 展 的 核 心 物 質［10］。 Smad是TGF-β1作用的底物，可以將 TGF-β1信號從細胞表面受體傳導至細胞核，調節細胞核內基因的轉錄過程。研究［11-12］表 明 TGF-β1／Smads信號轉 導通路在許多種疾病的發生、發展過程中起著非常重要的作用。本研究結果顯示，豬血清誘導的免疫性肝纖維化大鼠模型組肝臟組織中 TGF-β1含量明顯升高，美洲大蠊水提取物組 TGF-β1含量降低，提示美洲大蠊水提取物對免疫性肝纖維化大鼠的治療作用可能與其減少 TGF-β1的表達有關，具體機制如何，待進一步研究。

綜上所述，美洲大蠊水提取物對豬血清所誘導的免疫性肝纖維化大鼠有明顯的保護作用，機制可能與其抗氧化作用及減少 TGF-β1的表達有關。

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Protective effects of water extract of periplaneta americana on immunological liver fibrosis in rats

Xia Chao1，Wang Jiajia2，Li Fangqun1，et al
（1Dept of Gastroenterology，The Second Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230601；2Dept of Pharmacology，Anhui Medical University Hefei 230032）

Objective To investigate the protective effects andmechanisms ofwater extractof Periplaneta Americana on immunological liver fibrosis in rats.Methods SD ratswere random ly divided into six groups：normal control group，model group，water extract of Periplaneta americana（30 mg／kg，60 mg／kg，120 mg／kg）groups and positive control group（Colchicine 0.1 mg／kg）.Hepatic fibrosismodel was induced by intraperitoneal injection of pig serum，then the ratswere treated with different concentrations ofwater extractof Periplaneta Americana during the modeling of liver fibrosis；normal andmodel ratswere treated with equal dosage of saline.After12 weeks ofmodeling，rats were weighed and sacrificed.The liver and spleen index were calculated；the level of ALT，AST，HA，LN，PCⅢ，CⅣ in serum and SOD，MDA，GSH-Px in liver tissueswere tested.Additionally，liver samples collected after experimentwere stained with hematoxylin-eosin（HE）staining，masson staining and scored.The expression ofα-SMA and TGF-B1 in liver tissues was analyzed by immunohistochemistry and Western blot.Results Compared with themodel group，the liver and spleen index，the level of ALT，AST，HA，LN，PCⅢ，CⅣ in serum and the content ofMDA in liver tissuewere decreased.The SOD and GSH-Px activity were increased in water extract of Periplaneta americana groups.Water extractof Periplaneta americana could ameliorate liver histopathological lesion ofmodel rats.Moreover，water extract of Periplaneta americana could also decrease the protein expression ofα-SMA and TGF-β1 in liver.Conclusion Water extract of Periplaneta Americana significantly reduces pig serum-induced liver fibrosis in rats，probably by its free-radical scavenging ability and decreasing the expression of TGF-β1.

water extract of periplaneta Americana；immune hepatic fibrosis；pig serum；antioxidant；transforming growth factorβ1

R 285.5

A

1000-1492（2016）02-0199-06

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.022.htm l

安徽省自然科學基金（編號：1508085QH168）；安徽省公益性研究聯動計劃項目（編號：1501ld04046）

1安徽醫科大學第二附屬醫院消化內科，合肥 230601

2安徽醫科大學藥理學教研室，合肥 230032

夏 超，男，碩士研究生；

王佳佳，女，博士，副教 授，責 任 作 者，E-mail：ljedu＠163. com；

章禮久，男，主任醫師，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：zhanglijiu6336＠163.com