BMP-4對大鼠骨髓間充質干細胞與神經干細胞共培養轉歸影響的實驗研究

李海太，申才良，宋旆文，劉曉穎，楊 昆，杜 寧，王漢邦

BMP-4對大鼠骨髓間充質干細胞與神經干細胞共培養轉歸影響的實驗研究

李海太1，申才良1，宋旆文1，劉曉穎2，楊 昆1，杜 寧1，王漢邦1

目的探討骨形態發生蛋白-4（BMP-4）對經過骨髓間充質干細胞（BMSCs）共同培養后的大鼠神經干 細胞（NSCs）的存活和分化的影響。方法建立 BMSCs與 NSCs共培養模型，在共同培養體系中加入 BMP-4，采用流式細胞儀檢測 NSCs的存活率，同時利用細胞免疫熒光和 Western blot法鑒定 NSCs的分化情況，通過比較 NSCs的存活率和分化率，進而分析 BMP-4對共培養后 NSCs的存活及分化的影響。結果共培養體系加入 BMP-4后，大鼠 NSCs的細胞存活率低于對照組（P＜0.05），BMP-4促進了 NSCs向星形膠質細胞分化而阻礙其向少突膠質細胞分化，而分化后的神經星形膠質細胞的特異性表達蛋白神經膠質細胞酸性纖維蛋白（GFAP）的表達率高于對照組（P＜0.05），少突膠質細胞特異性蛋白髓鞘堿性蛋白（MBP）表達率低于對照組（P＜0.05）。結論BMP-4阻礙了 MSCs促進 NSCs有效分化的效應。

共培養；骨形態發生蛋白；骨髓間充質干細胞；分化；神經干細胞；存活

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是指表現為損傷脊髓平面以下的感覺以及運動功能完全或部分喪失為的一種中樞神經系統的嚴重性創傷疾病［1］。目前針對該疾病的主要治療方法在疾病后期通過細胞移植來進行 細胞的替 代 的 神經營養的 補 充［2］。研究［3］表明利用干細胞的多向分化潛能，特別是某些神經干細胞（neural stem cells，NSCs）能夠分化為特定的神經細胞，使脊髓的功能恢復以及 SCI修復成為可能。而骨形態發生蛋白-4（bone morphogenetic protein-4，BMP-4）是神經系統發育過程中必不可少的形態蛋白［4］，可以通過多種信號通路來完成對神經系統的生長和發育的調控［4］。該實驗采用體外分離培養出 NSCs，分析 BMP-4對 NSCs存活及分化的影響，為臨床治療 SCI提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 清潔級大鼠新生雌鼠 1只。SD雌性大鼠 1只，4～6周齡，100 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心。

1.1.2主要試劑 DMEM低糖細胞培養液（美國Hyclone公司）；DMEM／F12細胞培養液（美國 Gibco公司）；小鼠抗大鼠神經膠質細胞酸性纖維蛋白（glial fibrillaryacidic protein，GFAP）、兔抗小鼠抗微管相 關 性 蛋 白 2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）抗體、兔抗大鼠細胞髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）、小鼠抗大 鼠 細 胞 巢 蛋 白 抗 體（Nestin）、FITC標簽的山羊抗小鼠 IgG抗體 （美國Santa Cruz公司）；堿性細胞成纖維生長因子（basic fibrob lastgrowth factor，bFGF）、細胞表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和 B-27細 胞 因 子 （美國 PeproTech公司）；Triton X-100、TRITC標簽山羊抗兔 IgG抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；包被用 左 旋 氏 多 聚 賴 氨 酸 （Poly-L-Lysine）（美 國Sigma公司）；ECL蛋白顯影液試劑盒、BCA蛋白定量檢測試劑盒（美國 Pierce公司）；Transwell培養板（美國 Corning公司）；Hoechst33442、免疫熒光一抗稀釋液、免疫熒光二抗稀釋液、青／鏈霉素溶液（× 100）、即用型胰蛋白酶細胞消化液、抗熒光淬滅封片液（上海碧云天公司）；BMP-4（美國 Peprotech公司）；AnnexinV-PI凋亡試劑盒（美國 BD公司）。

1.2 方法

1.2.1體外分離和培養大鼠骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs） 本實驗從大鼠股骨和脛骨骨髓中分離出 BMSCs后采取骨髓貼壁法培養，細胞培養基由含 100 U／m l青鏈霉素及10%胎牛血清的 DMEM（低糖）組成，放置于含 5%CO2、37℃細胞恒溫培養箱中，每隔 2～3 d更換培養液。待細胞鋪滿培養瓶后，進行細胞傳代。細胞傳至第3代后，利用流式細胞術檢測分析細胞表面特異性標志物（CD90、CD29、CD34），并結合細胞形態學分析，證明所培養的細胞為大鼠 BMSCs。

1.2.2體外培養大鼠 NSCs 取 SD大鼠新生鼠，脫臼處死。浸泡在 75%酒精中 5 min后斷頭，依次分離出全腦組織并將腦膜及殘余血管剝除。用剪刀充分剪碎全腦組織，放入 1 ml即用型胰酶細胞消化液，放置于恒溫細胞培養箱中，時間為 8～10 min，加入含血清的 NSCs培養液以終止消化，轉移至篩網，過濾為細胞懸液，轉至 15 m l離心管，800 r／min離心 5 min。棄除管內上清液，加入 2 ml的無血清NSCs完全培養基并再次重復離心。加入完全培養基重懸細胞并進行細胞計數，調整密度為 105個／ml接種于細胞培養瓶，放于恒溫細胞培養箱中，每隔 3 d采取半量換液法更換培養基 1次，培養 7 d后傳代。傳至第 2代后，行免疫細胞化學熒光檢測 NSCs特異性蛋白（Nestin巢蛋白），證實所培養細胞為大鼠 NSCs。

1.2.3BMSCs與 NSCs共同培養 將第 3代后的BMSCs以 1×106／m l的細胞密度接種于共培養板的下室，在培養板上室內接種第 2代 NSCs，接種密度與下室細胞密度相同，保證培養液能夠在培養板上下室間相互通融，以后每隔 3 d進行換液，共培養 7 d，建立起大鼠 NSCs與 BMSCs的共同培養體系。

1.2.4BMP-4對 NSCs存活率影響實驗 采用 AnnexinV-PI細胞凋亡試劑盒，利用流式細胞術測定誘導凋亡后的 NSCs的存活率，步驟如下：① 將 NSCs分為 4組并進行編號后分別接種于 24孔板中，每孔約 1 ml，其中第 3組和第 4組為共培養的 NSCs，第 1組和第 2組細胞為獨立培養的 NSCs，② 第 2組（H2O2組）加入 100μmol／ml的 H2O2，第 1組（對照組）加入等量的 PBS，第 3組（H2O2+共培養組）加入 100μmol／ml的 H2O2，第 4組（H2O2+共培養 + BMP-4組）加 入 100μmol／m l的 H2O2和 2 ng／ml BMP-4，溫箱培養 4 h；③ 將細胞計數后，以 1 000 r／min離心 4 min，棄去上清液，加入適量的 PBS緩沖液重懸上述細胞；④ 取細胞懸液 1 ml，1 000 r／min離心 4 min，去 除 上 清液后加入 100μl的 Binding Buffer，重懸細胞，加入 5μl經熒光標記的 Annexin-V試劑，充分混勻，避光條件下孵育 20 min；⑤ 加入5μl的 PI試劑后避光下孵育 5 min；⑥ 加入 400μl的細胞重懸液，混勻后立刻行流式細胞儀檢測分析細胞凋亡率。

1.2.5細胞分化實驗 將共培養后的 NSCs接種于經 0.1%多聚賴氨酸包被的玻片，實驗組加入 2 ng／m l BMP-4，對照組加入等量的 PBS，貼壁培養 7 d后，細胞形態上出現了明顯的分化，各蓋玻片大部分鋪滿細胞，以 GFAP（神經膠質細胞特異性標志物）、MBP（少突膠質細胞特異性表達蛋白標志物）和MAP-2（神經元特異性標志物）行細胞免疫熒光染色檢測。用 PBS洗 3次，每次 5 min，常溫下使用免疫熒光染色固定液固定 20 min；吸去殘液后用 PBS緩沖液洗 3次，每次 5 min；0.1%Triton X-100中孵育20 min；PBS緩沖液洗 3次，每次 5 min。用正常山羊血清封閉液于37℃恒溫細胞培養箱中封閉 1 h，將免疫熒光一抗抗體 MAP-2、MBP、GFAP抗體均按1∶100稀釋混合均勻后分別依次加入各培養孔內，在4℃冰箱條件下孵育過夜；第 2天放置常溫下 2 h，PBS緩沖液洗 3次，每次 5 min；后加入 TRITC標簽山羊抗兔 IgG（1∶100）及 FITC標簽的山羊抗小鼠 IgG抗體（1∶100），于 37℃恒溫細胞培養箱內避光孵育 1 h；用 PBS緩沖液漂洗 3次，每次 5 min。Hoechst染色 5 min后 PBS漂洗 3次，每次 5 min。抗熒光淬滅封片液封片后馬上用免疫熒光顯微鏡觀察同時拍照。

1.2.6Western blot法檢測細胞分化后 MBP、MAP-2、GFAP蛋白的表達 BMSCs與 NSCs共同培育后，將 NSCs接種在經 0.1%多聚賴氨酸包被的大玻片上，其中實驗組加入 2 ng／ml BMP-4，對照組加入等量的 PBS，貼壁培養7 d。提取各組細胞分化后的總蛋白，用 BCA蛋白定量檢測試劑盒測定各組蛋白含量，確定電泳上樣量為 20μg，蛋白行 10%SDSPAGE凝膠電泳，PVDF轉膜，非特異性封閉。加入一抗 MAP-2、GFAP、MBP單克隆抗體，所使用抗體稀釋濃度為 β-actin（鼠單抗，1∶1 000）、GFAP（兔多抗，1∶500）MAP-2（小鼠單抗，1∶200）、MBP（小鼠單抗，1∶1 000）。4℃冰箱內孵育過夜，加入對應的二抗；4℃孵育 1 h，用 ECL發光劑時間為 1～5 min，通過進行曝光、顯影、定影一系列操作后使用數碼分析成像系統軟件對實驗結果進行統計分析，用目的蛋白的灰度值表示相對表達的目的蛋白水平。

1.3 統計學處理采用 SPSS 16.0軟件進行分析，兩組間比較使用 t檢驗，多組間比較采用方差分析。

2 結果

圖1 流式細胞術檢測大鼠 BMSCs特異性表面標志物A：CD90；B：CD29；C：CD34；紅色條帶代表表達陽性細胞；灰色條帶代表未表達對照組

2.1 大鼠BMSCs的形態學觀察及鑒定原代BMSCs在接種起始，細胞大部分呈懸浮狀態，24 h后首次換液，可見懸浮細胞明顯減少，鏡下已可見部分貼壁細胞，細胞大小不均一，形態各不相同。培養約4～5 d后見細胞數量逐漸增多，貼壁細胞呈菱形、梭形等形態。第 3代以后，細胞形態大體均勻一致。取第 3代的 BMSCs進行流式細胞術檢測細胞特異性表面標志物 CD90、CD29、CD34。見圖1。與對照組比較，CD90、CD29的熒光值明顯向右偏移動，而 CD34的熒光值與對照組基本重疊，結合細胞形態學分析確定該細胞為 BMSCs。

2.2 大鼠NSCs鑒定體外分離的原代 NSCs培養2～3 d后可見細胞聚集成球形懸浮生長，培養至第7天時培養瓶內可見大量細胞的集落，折光性較強。見圖2。取貼壁后的神經干細胞球，行 NSCs特異性蛋白 Nestin熒光染色檢測，結果見細胞球中細胞表達 Nestin，見圖3A。

圖2 神經干細胞的原代培養及分化 ×100 A：NSCs原代培養；B：分化的 NSCs；1：3 d；2：7 d

2.3 BMP-4對NSCs分化的影響BMSCs與 NSCs共培養后，接種于經 0.1%多聚賴氨酸包被的玻片，實驗組 加 入 2 ng／ml BMP-4，對 照 組 加 入 等 量 的PBS，貼壁培養 3 d后，細胞形態發生明顯，7 d后細胞形態上已出現了明顯的分化，光鏡下示細胞球向周邊放射狀生長，交織更緊密，間隙更窄。見圖2。細胞免疫熒光可見 GFAP陽性的星形膠質細胞，MAP-2表達陽性的神經元細胞以及 MBP表達陽性的少突膠質細胞。見圖3。

圖3 NSCs免疫熒光染色陽性結果 ×400 A：Nestin；B：GFAP；C：MAP-2；D：MBP

2.4 BMP-4對NSCs存活率的影響流式細胞術檢測分析顯示共培養后的 NSCs存活率明顯提高，但在共培養體系中加入 BMP-4后細胞存活率出現一定程度的下降，經方差分析顯示，差異有統計學意義（F=29.373，P＜0.05）。見圖4。

2.5 Western blot法檢測MBP、MAP-2、GFAP的表達將接種的 NSCs培養 7 d后，提取蛋白后行Western blot法檢測，結果顯示，實驗組中 GFAP的表達量高于對照組（t=9.638，P＜0.05），而 MBP的表達量低于對照組（t=4.902，P＜0.05），MAP-2的表達差異無統計學意義（t=0.71，P＞0.05）。見圖5。

圖4 NSCs流式細胞儀分析結果及存活率比較A：對照組；B：H2O2組；C：H2O2+共培養組；D：H2O2+共培養+BMP-4組；與 H2O2組 比 較 ：*P＜0.05；與 H2O2+共 培 養 組 比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

圖5 NSCs分化后相關蛋白表達量比較與對照組比較：*P＜0．05，**P＜0.01

3 討論

SCI常見于工農業生產中發生的意外事故，全世界大約 2 500萬人殃患該損傷［5］。特定的 NSCs移植治療 SCI是目前最有潛力的治療方法，但是由于 SCI后微環境并不有利于 NSCs的定植、存活及分化［6］，仍需要進一步探究 NSCs新的移植方法。研究［7］表明在 SCI早期 BMPs迅速增高，持續約 3 d，后逐漸減低，增高的 BMPs有阻礙 MSCs促進神經前體細胞分化成少突膠質細胞的作用。本實驗通過流式細胞儀檢測 NSCs的存活率及 Western blot法檢測 NSCs分化后特異性蛋白檢測及差異性分析，結果表明 BMP-4抑制共培養后的 NSCs的細胞存活率，而且促進 NSCs向星形膠質細胞方向分化抑制其向少突膠質細胞分化。

NSCs移植治療 SCI的成功前提首先是移植后的 NSCs能夠存活，但 SCI初期的微環境并不利于NSCs的存活和定植［6］。本研究利用特定濃度的雙氧水制作細胞凋亡模型，探究不同環境下 NSCs的存活率，顯示單獨培養的 NSCs經雙氧水誘導后存活率大幅度下降，這與 Hu et al［8］的實驗研究結果相似，同時經過于共培養后的 NSCs的存活率有明顯的提升，這可能與 MSCs分泌的細胞因子有保護NSCs的作用有關［9］。而在相同共培養體系中加入BMP-4后發現 NSCs的存活率出現一定程度的下降，表明 BMP-4有抑制 MSCs保護 NSCs的作用。BMP-4是轉化生長因子超家族（TGF）的一員，生物學活性比較廣泛，作用于神經發育的不同階段，有調節細胞存活 及分化 的作用［10］。研究［9］表明 MSCs能夠分泌多種細胞因子，作用于 NSCs，促進其存活及分化。推斷 BMP-4可能通過拮抗 MSCs分泌某種細胞因子重新從而抑制 NSCs的存活，如細胞信號轉導 Olig2信號通路、Notch相關信號通路等。但具體作用機制仍需進一步研究中去探索。

在治療 SCI的過程中 NSCs的分化方向也起到非常重要的作用，研究［11］顯示 NSCs可定向分化為少突膠質細胞、星形膠質細胞和神經元細胞，而對SCI的治療起主要作用的是神經元細胞和少突膠質細胞。本實驗通過采用 Western blot法 檢測 NSCs不同分化過程中的特異性蛋白的表達率，結果表明BMP-4作用于共培養體系后 MBP表達量減低而GFAP表達量升高，Sandner et al［12］發現 BMPs有阻礙 MSCs促進神經前體細胞分化成少突膠質細胞的作用。存在于成體中樞神經系統的大多數區域，受體表達量低，但在神經系統出現損傷后表 BMP受體達升高［13］，增高的 BMP受體有阻礙 MSCs促進神經前體細胞分化成少突膠質細胞的作用［12］，本研究結果與之一致，具體作用機制將進一步研究。

綜上所述，體內脊髓早期損傷因子 BMPs是阻礙 NSCs有效分化的重要因素之一，SCI早期 BMPs的增高將影響 MSCs促進 NSCs有效分化，本研究顯示 BMP-4阻礙了 MSCs促進 NSCs有效分化，這將導致 MSCs與 NSCs早期共同移植后的 NSCs并不能有效的分化為神經元細胞或少突膠質細胞，不能達到NSCs移植的理想的預期治療效果。雖然 BMSCs的培養基具有促進 NSCs向少突膠質細胞方向分化的作用［14］，但本實 驗在體 外環境 下研究 顯示 BMP-4對 MSCs與 NSCs共培養體系有重要的影響作用，這也間接提示 MSCs與 NSCs早期共同移植不利于兩者協同效應的發揮，這將為 SCI的治療方法帶來突破性的進展。

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Effect of BMP-4 on neural stem cells co-cultured w ith rat bonemarrow mesenchymal stem cells

LiHaitai，Shen Cailiang，Song Peiwen，et al
（Deptof Spine Surgery，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

Objective To explore the effect of bone morphogenetic protein（BMP-4）on survival and differentiation of neural stem cells（NSCs）co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells（MSCs）.Methods Firstly，themodeling of MSCs co-cultured with NSCs was set up，then BMP-4 was put into this co-culture system.After that，the survival rate of NSCswas detected by the flow cytometry（FCM）and expression of NSCswas detected by immunocytochemistry and Western bolt.By comparing the rates of cell survival and differentiation，the effect of BMP-4 on survival and differentiation of NSCswas analyzed.Results After addition of BMP-4，the survival rate of neural stem cellswas lower than the control group（P＜0.05），the expression ofMBPwas lower than the control group（P＜0.05），and the expression rate of GFAP was higher than the control group（P＜0.05）.Conclusion BMP-4 hinders the differentiation effect of MSCs，promotion on NSCs.

co-culture；bonemorphogenetic protein；bone marrow mesenchymal stem cells；differentiation；neural stem cells；survival

R 363

A

1000-1492（2016）02-0205-05

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.024.htm l

2015-11-11接收

國家自然科學基金（編號：81472088）；安徽省自然科學基金（編號：1508085MH152）

1安徽醫科大學第一附屬醫院脊柱外科，合肥 230022

2安徽醫科大學生物科學學院生物學系，合肥 230032

李海太，男，碩士研究生；

申才良，男，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：shencailiang1616＠163.com