膠質瘤中 IGF-1和 IGFBP-3的表達及臨床意義研究

葉 昀，牛朝詩，楊 洋，李冬雪，鮑得俊，范 振

膠質瘤中 IGF-1和 IGFBP-3的表達及臨床意義研究

葉 昀1，2，牛朝詩1，楊 洋1，李冬雪1，鮑得俊1，范 振1

目的檢測胰島素樣生長因子-1（IGF-1）和胰島素樣生長因子結合蛋白-3（IGFBP-3）在膠質瘤患者術前、術后外周血血清中的含量及變化和膠質瘤組織局部的表達情況，探討發生發展的關系及其在輔助診斷、危險性預測和治療中的臨床意義。方法運用化學發光法檢測膠質瘤組和對照組患者術前、術后 外 周血血清 中 IGF-1、IGFBP-3的水 平；正常腦組織（顱腦損傷手術時的腦組織）和腫瘤組織行 IGF-1、IGFBP-3免疫組化染色檢查，顯微鏡下觀察免疫組化染色結果。結果對照組 血 清中 IGF-1及 IGFBP-3術 前 及術后無明顯變化，差異無統計學意義；而膠質瘤患者血清中 IGF-1及 IGFBP-3表達水平在術后較術前均明顯下降（P＜0.05）。無論術前術后，IGF-1和 IGFBP-3在不同 級別膠 質瘤患者的血清學表達與級別無顯著相關性。膠質瘤組織中，IGF-1表達水平顯著提高（P＜0.05），IGFBP-3在膠質瘤中的表達亦高于對照組（P＜0.05）。膠質瘤級別越高，膠質瘤組織中IGF-1和 IGFBP-3的 表達 越 高，與 病 理 級別 呈 正 相 關 （P＜0.01）。結論IGF-1和 IGFBP-3可能在促進膠質瘤的發生、發展有重要作用，檢測其水平變化對膠質瘤的診斷、判斷預后有重要意義。

膠質瘤；胰島素樣生長因子-1；胰島素樣生長因子結合蛋白-3

膠 質 瘤，尤 其 是 膠 質 母 細 胞 瘤 （glioblastoma multiforme，GBM），目前仍然是死亡率最高的惡性腫瘤之一。GBM的外科手術治療、影像學診斷以及放化療已取得一定的進展。但是，由于膠質瘤有高度侵襲性，手術治療往往無法完全切除，而且手術復發率高，尤其是 GBM 患者仍預后極差［1］。胰島素樣生長因 子 （insulin-like growth factor，IGF）是 一 類多肽，可參與脊椎動物細胞增殖分化、組織修復及生長發育，有胰島素樣合成代謝作用，包括 IGF-1、IGF-2及其受體 IGF-1R、IGF-2R，以及 6種高結合蛋白（IGFBPs）和 IGFBP蛋 白酶。在 胚 胎 期 和 胎 兒 期IGF-2發揮，但在出生后，其作 用被 IGF-1替代［2］。IGFBPs作為 IGF-1在循環系統中的載體，可以決定IGFs的生物利用度，IGFBP-3在 IGFBPs中占有主要作用。研究［3］顯示，IGF-1血清學表達水平高的人群，患惡性腫瘤的風險要遠高于 IGF低表達人群。在膠質瘤方面，IGF-1和 IGFBP-3的相關研究還較少。該研究通過分析 60例各級別膠質瘤患者 IGF-1和 IGFBP-3的血清學表達、腫瘤組織中蛋白水平表達及其與病理級別的相關性，探討 IGF-1和 IGFBP-3作為膠質瘤預后指標的可能性，也為進一步研究膠質瘤的分子靶向治療提供了一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑IGF-1測定試劑盒及 IGFBP-3測定試劑盒均購于西門子醫學診斷產品（上海）有限公司；IGF-1兔抗人單克隆抗體（bs-4588R）、IGFBP-3抗體（bs-1434R）購于北京博奧森生物技術有限公司；兔二步法檢測試劑盒（PV-6001）購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 病例資料選取安徽醫科大學附屬省立醫院神經外科 2014年 5月 ～2015年 5月間行手術切除的膠質瘤患者血液標本和腫瘤組織標本，術后經病理檢查確診。其中女 26例，男 34例；年齡 6～63歲，中位年齡 36歲。膠質瘤患者均為初發病例，術前未進行任何抗腫瘤治療。根據 WHO 2007中樞神經系統腫瘤分類標準進行組織學分類及分級：Ⅰ級6例，Ⅱ級 9例，Ⅲ級 15例，Ⅳ級 30例。15例正常血液標本取自三叉神經痛、面肌痙攣患者，經檢查排除惡性腫瘤、惡病質等疾病，血液標本的采集均經過患者本人同意并簽署知情同意書。6例正常腦組織標本取自顱腦損傷行內減壓術的患者，術后病理檢查為正常腦組織，因入院時患者已昏迷，由其法定代理人簽署知情同意書，并通過醫院倫理委員會的批準。

1.3 方法

1.3.1血清采集及檢測 選取無菌干燥管，于清晨空腹抽取患者靜脈血4 ml，迅速置于冷凍離心機上，4℃，1 500 r／min離心 10 min。然后選取上清液置于冰箱（-25℃）冷凍保藏待檢查。若血液標本溶血則需重新采血離心處理。按化學發光免疫分析法步驟測定 IGF-1、IGFBP-3血清學中的含量。

1.3.2標本取材和制備 60例膠質瘤患者標本及6例正常腦組織標本均浸泡在甲醛液中，并立即包埋石蠟塊，室溫下保存待常規 HE切片染色及免疫組化染色檢查。

1.3.3免疫組化染色 取膠質瘤和正常腦組織組織標本，常規石蠟切片，烤箱 70℃脫蠟 2 h后，酒精梯度水化，置于檸檬酸中高溫高壓修復，分別加入IGF-1和 IGFBP-3單克隆抗體，4℃過夜。第二天取出，加入二抗室溫孵育 20 min，甩干，加入 DBA顯色、復染、脫水、封片、光鏡下觀察，以 PBS代替一抗作用性對照，已知陽性切片作陽性對照。IGF-1及IGFBP-3免疫組化結果判斷標準：IGF-1以胞質染色為棕褐色顆粒者為陽性反應細胞，IGFBP-3以細胞核、胞質和（或）包膜內染色為棕褐色顆粒者為陽性反應細胞，400倍顯微鏡下，每張玻片記數 500個細胞，依據染色陽性細胞所占總細胞的百分比及染色強弱分類：① -：標本中無陽性反應細胞或陽性反應細胞 ＜10%，染色淡；② +：陽性反應細胞占10%～25%，染色淡；③ ?：陽性反應細胞占 26% ～50%，染色清晰；④ ?：陽性反應細胞 ＞50%，染色強。

1.4 統計學處理使用 SPSS 17.0統計軟件進行分析，定量資料使用 ˉx±s表示。采用 t檢驗、單因素方差分析進行組間差異比較，定性資料采用秩和檢驗統計分析，等級資料兩變量相關性采用 Spearman等級相關分析。

2 結果

2.1 術前術后膠質瘤血清中IGF-1和IGFBP-3的表達對照組血清中 IGF-1及 IGFBP-3術前及術后無明顯變化，差異無統計學意義；而膠質瘤患者血清中 IGF-1及 IGFBP-3表達水平在術后較術前均明顯下降，差異有統計學意義 （t=19.71，17.61，P＜0.05）。見表 1。

表1 血清 中 IGF-1和 IGFBP-3術 前術 后的表 達（ˉx±s）

2.2 IGF-1血清學表達水平與膠質瘤級別的相關性研究無論術前術后，IGF-1和 IGFBP-3在不同級別膠質瘤患者的血清學表達與級別無顯著相關性。見表2。

2.3 膠質瘤組織中IGF-1和IGFBP-3的表達與對照組相比，膠質瘤組織中 IGF-1表達水平顯著提高，差異有統計學差異（Z=-2.37，P＜0.05）。IGFBP-3在膠質瘤中的表達亦高于對照組（Z=-2.37，P＜0.05）。見表 3、圖1。

圖1 IGF-1、IGFBP-3在正常腦組織和各級別膠質瘤組織中的表達免疫組化 ×4001：IGF-1；2：IGFBP-3；A：正常腦組織中表達（-）；B：星形細胞瘤Ⅰ級組織中表達（+）；C：星形細胞瘤Ⅱ級組織中表達（?）；D：星形細胞瘤Ⅲ級組織中表達（?）；E：星形細胞瘤 IV級組織中表達（?）

表2 各級 別膠質瘤血 清中 IGF-1和 IGFBP-3術 前術 后的表 達（ˉx±s）

表3 IGF-1及 IGFBP-3在對照組和膠質瘤組組織中表達水平比較

2.4 各級別膠質瘤組織中IGF-1和IGFBP-3的表達膠質瘤級別越高，膠質瘤組織中 IGF-1和 IGFBP-3的表達水平越高，與病理級別呈正相關（rs= 0.74、0.68，P＜0.01）。見表 4。

表4 不同級別膠質瘤組組織中 IGF-1及 IGFBP-3表達水平的比較

3 討論

大腦的形成和發展有許多特定環節，包括神經胚形成、神經發生、分化為神經元細胞和神經膠質細胞、遷移、樹突和軸突生長、突觸發生和髓鞘形成等，IGF-1幾乎在每個階段都發揮著重要作用［3-4］。研究［5］顯示，在人類腫瘤發生中，IGF-1過度增多可發揮“致瘤”作用，可促進增殖及侵襲性，并有抗凋亡作用，主要通過 PI3K-AKT-mTOR實現抗凋亡作用，而通過上調促血管生成因子完成促血管生成作用。目前研究表明，肺癌、前列腺癌、結腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤的發病率與循環中 IGF-1水平異常升高呈明顯正相關。

目前國內外關于膠質瘤與 IGF-1相關性的大樣本報道較少，本研究表明 IGF-1膠質瘤中高表達，在Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤中的表達顯著高于Ⅰ、Ⅱ級膠質瘤，提示 IGF-1作為癌 基因可能參與膠質瘤的發生發展，IGF-1血清學檢測可能作為膠質瘤篩查指標，為膠質瘤的臨床診斷提供參考。

IGFBPs家族包括 6個成員（IGFBP1～6），通過結合并調控 IGFs而發揮作用。研究［6］報道，IGFBP-3在許多腫瘤中發揮重要作用，GBM血清學檢測高表達 IGFBP-3的膠質瘤手術患者生存期更長。miRNA可參與調節 mRNA的穩定性，影響 mRNA翻譯，為一類非編碼小 RNA。近年來，人們越來越重視miRNA在腫瘤發生發展中起到的作用［7-11］。miR-21是膠質瘤重要的致癌基因，可靶向作用于轉化因子 β、p53以及線粒體凋亡腫瘤抑制通路中的多個組分，抑制膠質瘤細胞凋亡，增強膠質瘤細胞的侵襲和增殖能力［11-12］。

研究［1］顯示，IGFBP-3高表達可抑制 GBM細胞增殖，并且提示預后更佳。而 IGFBP-3正是 miR-21的靶基因，通過對 GBM 細胞系的研究表明，miR-21通過靶向抑制 IGFBP-3表達，促進膠質瘤細胞的增殖、侵襲及致瘤性。一旦敲減 GBM細胞中的 miR-21，則 IGFBP-3表達升高，GBM細胞的致瘤性受到抑制。提示 IGFBP-3可能作為抑癌基因發揮作用。本研究顯示 IGF-1及 IGFBP-3在膠質瘤患者手術前后的血清學檢測存在差異，術后均顯著下降；繼續通過免疫組化，表明在膠質瘤組織中，IGF-1及 IGFBP-3均高表達表達，并且與病理級別呈正相關。

IGF-1有作為膠質瘤治療靶點的可能性，但 IGFBP-3的抑癌作用及相關機制尚未完全清楚。進一步研究 IGF家 族的內在關系，尤 其 是 IGFBP-3及IGF-1的對膠質瘤細胞發生發展的影響，可能對膠質瘤的基因靶向治療提供新的思路。

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Research of expression and clinical significance of IGF-1 and IGFBP-3 in glioma

Ye Yun1，2，Niu Chaoshi1，Yang Yang1，et al
（1Dept of Neurosurgery，Anhui Province Key Laboratory of Brain Function and Brain Disease，Anhui Provincial Stereotactic Neurosurgical Institute，Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Hefei 230001；2Dept of Neurosurgery，People’s Hospital of Shuchen，Shuchen 231300）

Objective To explore the exact roles of IGF-1 and IGFBP-3 in the development of glioma and analyze their clinical significance in auxiliary diagnosis，risk prediction and therapy.Methods Chemiluminescencemethod was used to detect the contents and their change of IGF-1 and IGFBP-3 in serum of glioma group and control group pre and post operation.Immunohistochemistry was used to detect the expressions of IGF-1 and IGFBP-3 in glioma tissues and normal brain tissues.Results Compared to pre operation，the postoperation contents of IGF-1 and IGFBP-3 in glioma group significantly decreased（P＜0.05），while the data of the control group had no obvious difference.Nomatter pre or postoperation，the expressions of IGF-1 and IGFBP-3 in serum were irrelevant to the pathologic gradation of glioma.The expressions of IGF-1 and IGFBP-3 significantly increased（P＜0.05）and were positively correlated with the pathologic gradation（P＜0.01）.Conclusion IGF-1 and IGFBP-3 might promote the development of glioma and detect the contents and their changes have important value in the diagnosis and prognosis.

glioma；insulin-like growth factor-1；insulin-like growth factor binding protein-3

R 739.41

A

1000-1492（2016）02-0231-04

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.036.htm l

2015-11-17接收

安徽省重點實驗室績效考核補助項目 （編號：1306c083028）

1安徽醫科大學附屬省立醫院神經外科、腦功能與腦疾病安徽省重點實驗室、安徽省腦立體定向神經外科研究所，合肥 230001

2舒城縣人民醫院神經外科，舒城 231300

葉 昀，男，碩士研究生；

牛朝詩，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：niuchaoshi＠163.com