WWP1、p53在瘢痕疙瘩和正常皮膚中的差異表達及意義

王 輝，桑鵬飛，王 敏，張錦松，朱 飛

WWP1、p53在瘢痕疙瘩和正常皮膚中的差異表達及意義

王 輝，桑鵬飛，王 敏，張錦松，朱 飛

目的探討 E3泛素連接酶 WWP1、p53在人正常皮膚及瘢痕疙瘩組織中的表達差異，分析其與瘢痕疙瘩發生是否相關。方法選取臨床切取的瘢痕疙瘩及正常皮膚組織標本各 10例，采用免疫組織化學法和 RT-PCR法分別對組織中 WWP1、p53蛋白及 mRNA表達情況進行檢測，并通過Image-Pro Plus圖像分析系統測定組織蛋白染色后累計光密度值、以 β-actin為參照計算 mRNA相對定量，進而比較分析兩組標本中 WWP1、p53表達是否有差異性。結果免疫組化染色結果提示，瘢痕疙瘩標本中 p53蛋白表達明顯低于正常皮膚，而 WWP1蛋白沉積明顯高于正常皮膚，同時 p53及WWP1 mRNA RT-PCR檢測證實同樣結果，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論E3泛素連接酶 WWP1及抑癌基因p53與瘢痕疙瘩的形成有相關性，可作為瘢痕疙瘩形成機制及治療靶點研究的方向。

WWP1；p53；瘢痕疙瘩；正常皮膚

瘢痕疙瘩是一種表現為皮膚侵襲性生長的病理性修復，與腫瘤有類似的生物學特性，有一定的遺傳傾向，由多基因多因素共同作用所致。該疾病好發于胸骨區、肩部、面頸部及耳部等色素沉積的部位，常見于損傷后的 3個月 ～1年，輕微創傷即出現瘢痕疙瘩的極有可能有家族史。研究［1］表明 E3泛素連接酶 NEDD4-1基因可能與瘢痕疙瘩有關。E3泛素連接酶為 NEDD4蛋白家族成員之一，已被證實在多種 腫 瘤 中 表 達 異 常。研 究［2］顯 示 肝 癌 細 胞WWP1高表達，而 WWP1基因敲除后，肝癌細胞生長受到抑制，并導致細胞凋亡。為進一步探究WWP1、p53與瘢痕疙瘩之間的關系，該實驗通過免疫組織化學法和 RT-PCR法分別檢測瘢痕疙瘩與正常皮膚組織 WWP1、p53表達并比較是否有差異，進而探討二者與瘢痕疙瘩形成是否相關。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 選取安徽醫科大學第一附屬醫院整形外科手術切除的經副主任以上醫師確診為瘢痕疙瘩的瘢痕疙瘩標本 10例，年齡 10～52（33.1± 9.7）歲，其中男 6例，女 4例；正常皮膚標本 10例（取自非瘢痕疙瘩植皮患者取皮區的正常皮膚），年齡 10～52（31.8±7.4）歲。按照我院倫理委員會的準則，以上標本均在獲得患者知情同意并簽署知情同意書的基礎上進行手術切除。切取標本患者術前均無長期外用防治瘢痕藥物史，不伴有腫瘤等其他嚴重疾病。所取標本分為2部分（其中瘢痕疙瘩標本取中心部位），一部分行實時定量 PCR（Real-time PCR，RT-PCR）檢測標本切取后立即置于 -80℃冰箱保存，另一部分作免疫組化染色標本于 4%中性甲醛固定。

1.1.2主要試劑 兔抗人泛素轉移酶 E3 WWP1多克隆抗體、兔抗人 p53蛋白多克隆抗體、山羊抗兔IgG抗體（Santa Cruz公司，美國）；DAB顯色試劑盒（博奧森生物科技有限公司，北京）；RT-PCR試劑盒（Promega公司，美國）；目的片段及內參引物（上海生工生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學法檢測組織中 WWP1、p53蛋白表達 3μm連續切片，經過脫蠟后，置于枸櫞酸溶液中，在 270℃下抗原修復；以 3%雙氧水清除內源性過氧化物酶，PBS沖洗后加兔抗人泛素轉移酶E3多克隆抗體及 p53蛋白多克隆抗體孵育過夜；PBS沖洗，山羊抗兔 IgG抗體于 37℃孵育 30 min，PBS沖洗后，使用 DAB試劑盒按照說明書顯色。設立陰性對照（不與一抗孵育）。脫水封片后顯微鏡下觀察并拍照。使用 Image-Pro Plus圖像分析系統進行分析，測定泛素轉移酶 E3及 p53蛋白累積光密度 （integrated optical density，IOD）值。光 密 度（optical density，OD）是指光線通過溶液或某一物質前的入射光強度與該光線通溶液或物質后的透射光強度比值的對數，而 IOD則是陽性目標所有像素點OD值的累計，可以反映目標中總的表達強度，其值越高，說明目標總表達強度越高。

1.2.2RT-PCR法檢測組織中 WWP1、p53 mRNA表達 從 -80℃液氮罐中取出瘢痕疙瘩組織、正常皮膚組織各約 100mg分別放入用0.1%DEPC水浸泡并消毒過的勻漿器中，向勻漿器內加入 1 ml TRIzol RNA提取液，置于冰上。以 TRIzol法提取組織中總 RNA，并用紫外分光光度計檢測 RNA濃度和純度 （OD260／OD280＞1.8）。根 據 濃 度 取 1μg總RNA，按照逆轉錄試劑盒操作說明將 RNA逆轉錄為cDNA，進 行 PCR 擴 增。人 β-actin上 游 引 物：5′-GGG ACCTGACTGACTACCTC-3′，下 游 引 物：5′-ACTCGTCATACTCCTGCTTG-3′，擴 增 片 段 長 度 546 bp；WWP1上游引物：5′-ACAGTGGCAATCTCAGCG-3′，下游引物：5′-GGCACAAATAACGGAAGT-3′，擴增片段 長度 413 bp；p53上 游 引 物：5′-GTCTACCTCCCGCCATAA-3′，下 游 引 物：5′-CATCTCCCAAACATCCCT-3′，擴增片 段長度 316 bp；擴增條件：94℃預變性 5 min，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，72℃終末延伸 10 min，共 35個循環。PCR產物經 2%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠分析系統觀察并照相，每個樣本至少重復3次。

1.3 統計學處理采用 SPSS 19.0軟件進行分析，計量資料 ˉx±s表示，組間差異采用 t檢驗。

2 結果

2.1 E3泛素連接酶WWP1、p53蛋白免疫組化染色對 p53蛋白染色顯示，瘢痕疙瘩組織內少見陽性細胞，見圖1。瘢痕疙瘩組織中 p53蛋白染色 IOD值顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。對瘢痕疙瘩及正常皮膚組織泛素連接酶 E3 WWP1染色結果分別進行觀察，泛素連接酶 E3 WWP1染色陽性者胞漿存在棕黃色顆粒沉著，鏡下顯示正常皮膚組織內少見陽性細胞，見圖1。與正常皮膚相比，瘢痕疙瘩組織泛素轉移酶 E3 WWP1染色 IOD值顯著增加（P＜0.05），見表 1。

表1 正常皮膚及瘢痕疙瘩組織 p53、WWP1免疫組化染色 IOD值測定結果

2.2 E3泛素連接酶WWP1、p53的mRNA RT-PCR檢測結果與正常皮膚相比，瘢痕疙瘩組織泛素連接酶 E3 WWP1 mRNA表達水平顯著增加，p53 mRNA的表達情況顯著減少，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、3。

圖1 瘢痕疙瘩及正常皮膚組織 p53及 WWP1免疫組化染色結果 DAB×400A：瘢痕疙瘩；B：正常皮膚；1：p53；2：WWP1

圖2 正常皮膚及瘢痕疙瘩組織中 p53、WW P1 mRNA及內參 β-actin PCR產物電泳圖1～3：正常皮膚組織及對應內參的目的條帶；4～6：瘢痕疙瘩組織及對應內參的目的條帶

圖3 正常 皮膚 及瘢 痕疙瘩 組織 中 p53、WWP1 m RNA表達 水平與正常皮膚比較：*P＜0.05；**P＜0.01

3 討論

瘢痕疙瘩是以局部創傷修復組織進行性生長并伴有膠原纖維過度產生和沉積為表現的一種嚴重病理性瘢痕，有腫瘤的某些特征，并有一定遺傳傾向，探索腫瘤相關基因及細胞因子對瘢痕疙瘩形成有重要意義。

WWP1基因位于 8q21，NEDD4家族部分蛋白已被證實通過泛素化過程參與多種細胞信號通路及腫瘤形成。目前關于瘢痕疙瘩中 WWP1發病機制的研究極少。本研究利用免疫組化及 RT-PCR方法發現 WWP1在瘢痕疙瘩中表達增多，這與在乳腺癌［3］、前列腺癌［4］等腫瘤所發現的情況一致。Cao et al［5］體外培養成纖維細胞研究顯示，WWP1通過泛素-蛋白酶體系統對 p27進行調控參與細胞周期調控，WWP1與 p27之間的變化呈負相關。已知p27是一種細胞周期依賴的蛋白激酶抑制劑，通過細胞間接觸抑制來完成細胞周期的阻滯作用（G0／G1期）。WWP1過度表達時 p27水平降低，細胞凋亡延遲，敲除該基因后成纖維細胞出現復制性衰老，p27蛋白增高［6-7］。此外，Cheng et al［2］發現肝癌細胞 WWP1表達水平升高，同時細胞凋亡水平明顯降低，利用 siRNA轉染敲除 WWP1基因后細胞凋亡水平明顯升高，p53表達上調。p53除有抑制腫瘤的作用外還能介導細胞凋亡，因此推測 WWP1是通過對其下游的 p53調控參與細胞的增值、凋亡。本研究同樣證實瘢痕疙瘩成纖維細胞 WWP1表達增多，推測可能也與其對下游調節因子的泛素化異常使成纖維細胞增殖凋亡異常有關。

p53基因是一種公認的抑癌基因，位于染色體17q13.1，既往與腫瘤發病機制的研究眾多。對瘢痕疙瘩 p53基因差異性的研究結論尚未統一，但普遍認為 p53功能的缺失可能促使成纖維細胞凋亡異常［8］。本實驗顯示瘢痕疙瘩組織中 p53表達較正常皮膚減少，這可能正是 p53蛋白無法執行細胞凋亡致成纖維細胞有較高增殖活性的原因。WWP1表達水平增高的同時 p53表達降低并非偶然，Laine et al［9］對老鼠纖維母細胞 WWP1、p53基因研究表明，WWP1通過泛素化介導 p53蛋白從細胞核輸出，p53發揮促細胞凋亡及抑癌作用是在細胞核內完成，因此泛素化抑制了 p53基因的轉錄活性，此外 WWP1對 p53的調節獨立于 MDM2。這種泛素化為非經典的泛素化途徑，結果并非將蛋白降解，而是通過泛素化修飾 p53蛋白并增加其穩定性，但泛素化了的p53蛋白無生物功能。

本實驗就 WWP1、p53在瘢痕疙瘩的表達進行研究，表明 p53表達減少，而 WWP1表達增多。p53功能缺失在乳腺癌、胃癌［10］等腫瘤常見，p53多以突變體形式存在，且這種突變體表達明顯升高，但本研究顯示瘢痕疙瘩中 p53表達較正常組織明顯減少，這至少說明在瘢痕疙瘩中 p53功能缺失，實驗對WWP1水平檢測，發現表達明顯增高，這一現象在其他腫瘤中亦存在［11］，且有證據表明 WWP1通過泛素化修飾 p53蛋白，因此推測瘢痕疙瘩的形成中成纖維細胞異常增殖可能與 p53功能缺失有關，而WWP1能夠通過對 p53的調控來實現細胞周期的控制，除此之外是否還有其他途經作用于 p53使其功能缺失尚無確切證據，待將來有關此方面的研究更加深入。

［1］Nakashima M，Chung S，Takahashi A，et al.A genome-wide association study identifies four susceptibility loci for keloid in the Japanese population［J］.Nat Genet，2010，42（9）：768-71.

［2］Cheng Q，Cao X，Yuan F，et al.Knockdown of WWP1 inhibits growth and induces apoptosis in hepatoma carcinoma cells through the activation of caspase3 and p53［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，448（3）：248-54.

［3］Yeung B，Ho K C，Yang X，et al.WWP1 E3 ligase targets LATS1 for ubiquitin-mediated degradation in breast cancer cells［J］.PLoS One，2013，8（4）：e61027.

［4］汪治宇 ，劉榮鳳 ，丁 妍 ，等.泛 素 連 接 酶 WWP1和 Smurfs在前列腺癌組織中的表達及其與骨轉移的關系［J］.中國現代醫學雜志，2012，22（20）：66-70.

［5］Cao X，Xue L，Han L，et al.WW domain-containing E3 ubiquitin protein ligase 1（WWP1）delays cellular senescence by promoting p27Kip1 degradation in human diploid fibroblasts［J］.J Biol Chem，2011，286（38）：33447-56.

［6］Polyak K，Kato JY，Solomon M J，et al.p27Kip1，a cyclin-Cdk inhibitor，links transforming growth factor-beta and contact inhibition to cell cycle arrest［J］.Genes Dev，1994，8（1）：9-22.

［7］Levenberg S，Yarden A，Kam Z，et al.p27 is involved in N-cadherin-mediated contact inhibition of cell growth and S-phase entry［J］.Oncogene，1999，18（4）：869-76.

［8］Teofoli P，Barduagni S，Ribuffo M，et al.Expression of Bcl-2，p53，c-jun and c-fos protooncogenes in keloids and hypertrophic scars［J］.JDermatol Sci，1999，22（1）：31-7.

［9］Laine A，Ronai Z.Regulation of p53 localization and transcription by the HECT domain E3 ligase WWP1［J］.Oncogene，2007，26（10）：1477-83.

［10］Yeung B，Ho K C，Yang X.WWP1 E3 ligase targets LATS1 for ubiquitin-mediated degradation in breast cancer cells［J］.PLoS One，2013，8（4）：e61027.

［11］Zhao L，Huang J，Zhang H，et al.Tumor necrosis factor inhibits mesenchymal stem cell differentiation into osteoblasts via the ubiquitin E3 ligase WWP1［J］.Stem Cells，2011，29（10）：1601-10.

Different expression and significance of WWP1 and p53 in keloid and normal skin

Wang Hui，Sang Pengfei，Wang Min，et al
（Dept of Plastic Surgery，The First Affiliated Hopital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective The purpose of the study was to detect the expression of E3 ubiquitin ligase WWP1 and p53 in human normal skin and keloid tissues and its correlation with the occurrence of keloid.Methods 10 cases of keloid tissues and 10 cases of normal skin were recruited.The expressions of WWP1 and p53 in the keloid group and the controlsweremeasured using immunohistochemicalmethods.And themRNA expression ofWWP1 and p53 in the two groups were detected by RT-PCR methods.We also measured integrated optical density（IOD）of the proteins by Image-Pro Plus analysis system，and calculated the relative quantity ofmRNA refering toβ-actin，then made a comparative analysis of the two groups for the expressions ofWWP1，p53.Resu lts The immunohistochemical results showed that the expression of p53 protein in keloid was significantly lower compared with the controls，and WWP1 protein deposition was significantly higher than that of normal skin.The mRNA expression of p53 and WWP1 was detected by RT-PCR and confirmed the same results.All the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion E3 ubiquitin ligase WWP1 and anti oncogene p53 is related to the formation of keloid，which provides a new direction of themechanism and new targets for the treatment of keloid.

WWP1；p53；keloid；normal skin

R 619.6

A

1000-1492（2016）02-0247-04

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.044.htm l

2015-11-23接收

國家自然科學基金（編號：30973124）；安徽省自然科學基金（編號：KJ2014A108）

安徽醫科大學第一附屬醫院整形外科，合肥 230022

王 輝，男，碩士研究生；

朱 飛，男，主任醫師，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：hfzfzx＠163.com