高銨脅迫下玉米根邊緣細胞的數(shù)量及存活率分析

摘 要 研究高銨脅迫下觀察玉米根邊緣細胞的形態(tài)、數(shù)量及存活率的變化情況。結(jié)果表明，10 μmol/L的硫酸銨對玉米的生根有促進作用，但超過該值，則會起到抑制作用。玉米的根長隨著硫酸銨的濃度上升而降低。玉米根長為3 cm時，根邊緣細胞的數(shù)量達到最大，為4 500個/cm3，隨著硫酸銨濃度的增加，邊緣細胞的數(shù)量呈現(xiàn)出減少的趨勢，而存活率則是先增加后再逐漸降低，說明低濃度的硫酸銨有利于植物的生長，在高銨脅迫下，根邊緣細胞起到對根際區(qū)域的保護作用。

關鍵詞 高銨脅迫；玉米；根邊緣細胞

中圖分類號：S513 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.08.003

銨在植物的新陳代謝以及生長發(fā)育過程中起著不可或缺的作用，它不僅是植物吸收利用的主要N元素形式之一，而且是植物的中間代謝產(chǎn)物[1]。在現(xiàn)代化的農(nóng)田生產(chǎn)中，由于一些特殊的施肥方式，如條施、穴施等及大量銨態(tài)氮肥的投入常常導致農(nóng)田土壤表層或局部累計大量的銨態(tài)氮，而大部分植物對銨較為敏感，當植物的根系處于過量的銨環(huán)境時，植物會出現(xiàn)銨中毒癥狀，主要表現(xiàn)為：根冠比降低、葉片萎黃、根系生長受阻、生物量下降甚至死亡[2]。

根系是連接植物土壤之上部分與土壤的媒介，是吸收水分及其他營養(yǎng)成分的關鍵器官，因此是各種土壤環(huán)境脅迫最為直接的毒害和響應器官[3]。根邊緣細胞，又稱脫落的根冠細胞，來源于根冠分生組織，是從根冠表皮游離出來并聚集在根尖周圍的一群特殊細胞。過去，人們認為根邊緣細胞沒有生物學活性，僅僅起到潤滑的作用[4]。然而最近幾年，越來越多的試驗證明，根冠脫落細胞是具有活性的。這群細胞通過多種機制減小惡劣環(huán)境給植物帶來的傷害，將不利因素對根尖的脅迫程度降到最低，從而保證植物的正常生長[5]。根邊緣細胞是獨立的細胞個體，其從根尖表皮脫離后，能夠自主進行新陳代謝，即能單個生存，并在遭受逆境時向外分泌黏液層，形成一個獨立的包際空間，形成一道天然的屏障，隔離植物根部與對植物產(chǎn)生各種脅迫的土壤。目前的研究表明[6]，根邊緣細胞通過改變基因的表達和蛋白質(zhì)合成在抵御環(huán)境脅迫造成的根尖傷害中起著多種防御和保護功能，并可以迅速向胞外釋放一些特異性的化學物質(zhì)，如抗生素、花色素苷、糖類和特異性酶類等來與根際環(huán)境中的脅迫因子發(fā)生反應，從而改變根際周圍的生態(tài)環(huán)境。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為68號特甜品種玉米品種。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米生根

種子用5%雙氧水消毒15 min后用蒸餾水清洗多次，浸泡4 h后在25 ℃培養(yǎng)箱中避光催芽12 h。選取剛露白的玉米種子，置于黑暗環(huán)境下25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，待玉米初生根長至1～1.5 cm，選取根長一致的種子。

1.2.2 高銨脅迫

以未經(jīng)硫酸銨處理的玉米為對照，將硫酸銨設置8個濃度處理組（10， 20， 25， 40， 50， 100， 200， 500 μmol/L）進行模擬高銨脅迫。每組放入15粒根長一致的玉米，并用不同濃度的硫酸銨溶液對玉米根表面進行噴灑后，25 ℃的恒溫培養(yǎng)24 h，收集邊緣細胞，測定細胞的數(shù)量和存活率，每個處理重復6次。

1.2.3 邊緣細胞數(shù)目統(tǒng)計及存活率檢測

1.2.3.1 數(shù)目統(tǒng)計

取長度為10， 15， 20， 25， 30， 40， 50 mm的玉米根，分別齊根剪下，加入裝有1 mL蒸餾水的Eppendorf管中，漩渦震蕩1 min，使邊緣細胞盡量脫落于蒸餾水中。然后用移液槍輕輕吹幾下，使邊緣細胞及其黏液在水中充分展開均勻，用移液槍從Eppendorf小管中的中間層吸取10 μL放在干凈的血球計數(shù)板上于光學顯微鏡下統(tǒng)計根邊緣細胞的數(shù)目。

1.2.3.2 存活率統(tǒng)計

取50 μL的邊緣細胞溶液與0.4%溴酚藍1∶1混合，染色10 min后，立即取10 μL于干凈的血球計數(shù)板上，根據(jù)染色結(jié)果，被溴酚藍染成藍色的為活細胞，未能染色的為死細胞，統(tǒng)計細胞存活率。

邊緣細胞的存活率=活細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同根長的玉米根邊緣細胞的數(shù)量和存活率變化

由圖1可見，玉米根邊緣細胞隨著根長度的增加，數(shù)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。在玉米根長為3 cm時，邊緣細胞的數(shù)量達到最大，為4 500個/cm3。由此可見，玉米根邊緣細胞的數(shù)量隨著其根系的生長而增多，在根的生長達到某個階段后其數(shù)量達到最大值。因此，推斷玉米根邊緣細胞的生長發(fā)育和根系的發(fā)育有著密切關系。

由圖2可知，細胞存活率則是隨著玉米根長度的增加先降低后增加。其中根長為1～1.5 cm時，根邊緣細胞存活率降最高，當根長增加至1.5 cm后，根邊緣細胞的存活率下降幅度明顯，當根長為3 cm時最小，只有29.31%。當根長大于3 cm，根邊緣細胞存活率又漸漸緩慢上升，當根長增加至4 cm時，存活率達到40.13%。由此可見，當玉米根長較短時，根邊緣細胞的存活率較高，而當根進入快速生長階段時，邊緣細胞的存活率快速下降。

2.3 高銨對玉米根邊緣細胞數(shù)量和存活率的影響

待種子露白后，播于裝有不同濃度硫酸銨溶液的培養(yǎng)皿中，放入25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等到根的長度達到1 cm后，觀察根邊緣細胞的數(shù)量和存活率，結(jié)果如表1和圖3所示。

由表1可知，隨著硫酸銨濃度的增加，玉米根邊緣細胞的數(shù)量以及活細胞數(shù)量整體呈下降趨勢。

但圖3顯示，隨著硫酸銨濃度增加，存活率變化先增加后減少的趨勢。當硫酸銨濃度為10 μmol/L的情況下，與對照組相比，存活率由68.75%變?yōu)?3.94%，有小幅度增加，但當硫酸銨的處理濃度為20 μmol/L時又大幅度降低，其細胞存活率卻只有50%。而當硫酸銨濃度達到40 μmol/L時，細胞存活率僅為29.62%，當硫酸銨濃度超過100 μmol/L時，細胞幾乎全部死亡，存活率為3.75%，硫酸銨濃度大于200 μmol/L時，細胞存活率為0。結(jié)果表明，10 μmol/L的硫酸銨對玉米根邊緣細胞有增加存活率的促進作用，但當硫酸銨的處理濃度大于10 μmol/L時則表現(xiàn)出脅迫作用。

2.2 高銨脅迫對玉米根邊緣細胞形態(tài)的影響

當玉米根長約為1 cm的時候，放入10、20、25、40、50、100、200 μmol/L硫酸銨的培養(yǎng)皿中，并在根的表面噴灑相應濃度的硫酸銨溶液，然后置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，24 h后取根邊緣細胞觀察其形態(tài)的變化。由圖4可知，與空白對照相比（圖4H），在40 μmol/L的硫酸銨脅迫下（圖4D），根邊緣細胞開始變得狹長并彎曲，且彎曲程度隨硫酸銨濃度增加而增大，細胞質(zhì)減少（如圖4 E、F、G），并且內(nèi)縮成一團，細胞內(nèi)各細胞器較難分辨，細胞呈現(xiàn)一種狹長彎曲的鐮刀形狀，且細胞存活率降低，死細胞數(shù)量急劇增多。

3 結(jié)論與討論

植物的生長發(fā)育與其根邊緣細胞有著極為密切的關系，根邊緣細胞的數(shù)量、形態(tài)以及存活率直接關系著植物的整個生命過程-根邊緣細胞可以影響植物的萌發(fā)、吸收營養(yǎng)等的過程。在植物根的發(fā)育初期，植物邊緣細胞的存活率為最大值，其數(shù)值一般為80%～95%，這與本實驗中的結(jié)果，即在玉米根長為1 cm時根邊緣細胞存活率約為87%相符合。此外本實驗還表明，細胞存活率是隨著玉米根長度的增加先降低后增加，其中根長較短時，根邊緣細胞存活率降低幅度較大，隨著根長增加，根邊緣細胞存活率只有較低程度的上升，如在玉米根長為3 cm時，邊緣細胞的數(shù)量達到最大值，為4 500個，但此時存活率為最低，約為30%。總體來說，當根長較短時，根邊緣細胞的存活率較高。分析其可能的原因是為隨著玉米根的生長，根邊緣細胞大量死亡。由此可見，玉米根邊緣細胞的數(shù)量隨著其根系的生長而增加，在根的生長達到某個階段后其數(shù)量達到最大值。因此，推斷玉米根邊緣細胞的生長發(fā)育和根系的發(fā)育有著密切的關系。

玉米種子的存活率隨硫酸銨濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，其中當硫酸銨的處理濃度為20 μmol/L時，種子的存活率為最高，當硫酸銨的處理濃度為40 μmol/L時，種子的存活率幾乎與空白組一致。再隨著硫酸銨濃度的增加，種子的存活率一直下降，研究表明，當處理濃度大于200 μmol/L時，硫酸銨對玉米種子的存活率的影響幾乎已經(jīng)達到極限。隨著硫酸銨的濃度逐漸增大，玉米的平均根長依次減少，前期減少的幅度較大，而后期則幾乎沒有什么太大的變化。

在細胞形態(tài)方面，當硫酸銨的處濃度大于40 μmol/L時，根邊緣細胞開始變得狹長并彎曲，且彎曲程度隨硫酸銨濃度增加而增大，細胞質(zhì)減少并內(nèi)縮成一團，細胞呈現(xiàn)一種狹長彎曲的鐮刀形狀，且細胞存活率降低，死細胞數(shù)量急劇增多。

隨著硫酸銨濃度的增加，玉米根邊緣細胞的數(shù)量逐漸減少，但存活率變化呈不確定的趨勢。同樣在硫酸銨濃度增加10 μmol/L的情況下，空白對照與硫酸銨的處理濃度為10 μmol/L時相比較存活率有小幅度增加，但當硫酸銨的處理濃度為20 μmol/L時又大幅度降低。而當硫酸銨濃翻一番達到40 μmol/L時，細胞存活率不及1/3，當硫酸銨濃度為100 μmol/L時，細胞幾乎全部死亡，硫酸銨濃度大于200 μmol/L時，細胞存活率為0。結(jié)果表明，10 μmol/L的硫酸銨對玉米根邊緣細胞有增加存活率的促進作用，但當硫酸銨的處理濃度大于10 μmol/L時則表現(xiàn)出脅迫作用。

研究表明[7]，目前對于植物根邊緣細胞的產(chǎn)生有兩種猜測，一種是只有當植物的根系長到一定程度，如側(cè)根數(shù)量、長度等符合要求，或是根長達到一定長度時，根邊緣細胞才開始產(chǎn)生，如豌豆[8]，當其初生根長度達到5 mm時，才會出現(xiàn)首個根邊緣細胞。另一種模型是在植物開始生根的時候，幾乎同時會生成根邊緣細胞，如番茄。本實驗研究結(jié)果表明，玉米根邊緣細胞的出現(xiàn)幾乎

與根的生長是同步進行的。結(jié)合其他研究數(shù)據(jù)，說明不同植物之間的根邊緣細胞生長的模式是有較大差異的，其模式之間差異的產(chǎn)生可能與植物本身相關的發(fā)育基因，以及基因的表達方式或是環(huán)境影響有關。

由于人為因素（如施肥等）或是環(huán)境改變（如干旱、多雨等）導致植物的根部周邊環(huán)境發(fā)生不利于植物的生長時，根邊緣細胞作為根際的“信號傳遞者”，會在第一時間對周邊環(huán)境的不利因素做出響應，其響應機制一般為通過根邊緣細胞的數(shù)量（細胞會進行自殺式的程序性凋亡等）、形態(tài)（細胞的變得狹長彎曲、細胞質(zhì)嚴重內(nèi)縮等）以及存活率等發(fā)生顯著的改變，或是根尖的根邊緣細胞會分泌黏液包裹住根尖，從而保護根際。

參考文獻

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（責任編輯：劉昀）