禽類受精過程中的精卵互作

摘 要：受精是有性生殖動物繁育下一代必不可少的過程。在過去數十年中，我們對哺乳動物精卵互作分子機制的理解已取得重要進展。然而，由于禽類的卵子較大和模擬發生在正常受精過程中的生理性多精受精過程有一定困難，我們在禽類精卵互作方面積累的知識并未達到類似于在哺乳動物上積累的水平。本文將總結目前人們對禽類受精過程中精卵互作機制的理解，尤其著重總結精卵結合、精子的頂體反應以及卵周膜通道形成所必需的真精子蛋白酶；解釋卵周膜中透明帶（Zona Pellucida，ZP）蛋白（ZP1和ZP3）在精卵結合、頂體反應誘導以及精子蛋白酶消化作用下的精子滲透作用。我們期望：對鳥類受精過程的更深刻理解，能夠為家禽行業中包括生產轉基因或克隆禽類在內的眾多應用開發強有力工具開辟新的途徑。

關鍵詞：頂體反應；受精；卵周膜；精卵互作；精子蛋白酶

中圖分類號：S831.3 文獻標識碼：C 文章編號：1001-0769（2016）12-0027-05

在任何有性生殖的動物中，受精是繁殖后代必不可少的過程。總體而言，受精是一個按時序逐步發生的重要生理過程，包括精卵物種特異性的結合、頂體反應的誘導、精子滲透進入卵子以及配子的融合。大量研究表明：透明帶（包圍在哺乳動物卵子周圍的卵膜）在受精過程中精卵互作的第一步上起著重要作用。當精子接觸到卵子時，它們必須先穿過透明帶，然后才能進行精卵融合。盡管我們尚未完全理解受精過程中這些生理活動的分子機制，但研究人員從利用如轉基因和基因敲除等反向遺傳技術的研究中，已找到了哺乳動物中調控受精過程的大量證據和關鍵作用分子。

與哺乳動物相比，禽類的卵子特別大，這導致我們無法在體外通過直接觀察禽類的精卵互作來研究這個過程。舉例來說，至今還未有可行的禽類體外受精（in vitro Fertilization，IVF）方法，研究人員只好將分離的卵周膜（哺乳動物透明帶的類似物）與采集的精子進行體外培養作為體外受精的替代模型。此外，由于系帶層（也稱為卵黃膜外層，由輸卵管漏斗部分泌）會在排卵后會迅速覆蓋在卵周膜表面，排出的卵子很快會失去受精能力。隨后，精子將不再與這些卵子互作，而被阻留在系帶層或卵清蛋白中。盡管存在這些困難，但包括我們實驗室在內的多個研究小組使用家養禽類（主要是雞和鵪鶉）研究了禽類受精的機制。

本文我們將總結人們對禽類受精過程中精卵互作機制的最新認識，特別是對精卵結合、精子頂體反應以及卵周膜孔形成所必需的真精子蛋白酶。

1 精卵結合

精卵結合是受精過程的第一步。1980年，Wassarman研究小組在小鼠上確定了3種透明帶蛋白ZP1、ZP2和ZP3，并發現ZP3負責（小鼠）物種特異性的精卵結合。在此基礎上，隨后研究人員也在很多動物的卵膜中鑒定出了精卵結合所必需的ZP蛋白。盡管ZP蛋白的結構和功能在進化上比較保守，但有趣的是不同動物的ZP蛋白來源卻不相同。例如，小鼠的3種ZP蛋白是在不斷發育的卵細胞中合成，而兔的ZP3蛋白則產生于卵巢顆粒細胞。在一些卵生動物（例如魚和鳥類）中，一些卵外膜蛋白由肝臟分泌，并經血液循環運輸至卵巢；不過，在非洲爪蟾中，卵細胞則是ZP蛋白的唯一來源。

我們之前報道了鵪鶉的卵周膜至少由5種蛋白組成（ZP1、ZP2、ZP3、ZP4和ZPD）。正如前言中所提及的，禽類無體外受精系統，一般以離體卵周膜作為研究精卵互作機制的替代途徑（圖1）。利用這個系統，我們曾報道了純化的鵪鶉ZP3蛋白的特異性抗血清在日本鵪鶉上能有效阻止精子穿透卵周膜。對于這一抑制現象，有3種可能的解釋：（1） 抗血清覆蓋了ZP3蛋白（精子的一個結合位點），從而阻止了精卵結合；（2） 抗血清阻止了精子的頂體反應；（3） 抗血清抑制了消化卵周膜的蛋白酶的作用。盡管我們沒有進行進一步的試驗，但Bausek等通過測試純化的ZP1或ZP3蛋白與精子的結合，證明了兩種ZP蛋白均能特異性地結合到精子頭部的頂端。然而，在雞上，僅ZP3蛋白能能夠通過與分子量為180 kDa的精子蛋白產生互作而發生結合反應。這些結果表明ZP3蛋白是雞和鵪鶉卵周膜上的精子結合蛋白，不過具體的精卵結合機制仍不清楚。在小鼠中，有報道稱ZP2蛋白也有助于精子結合；ZP2蛋白被卵巢皮質顆粒蛋白酶的有限消化會產生結構性改變，這能防止多精受精。在禽類中，ZP2蛋白表達于未成熟卵泡的卵細胞中，并作為一種微量組分存在于卵周膜中。前不久，Nishio及其同事證明了雞的ZP2蛋白在未成熟的卵細胞包被層中累積，并駐留在成熟卵子的胚盤區。盡管ZP2蛋白與精子的結合特性尚未進行測試，但研究雞中報道的ZP2蛋白位置是否與精子穿透卵子更多地發生在胚盤區的這種現象相關將會十分令人關注。要證明禽類中的精卵結合分子機制還需進一步的研究。

正如前文所述，ZP蛋白在精卵結合過程中起著重要作用。然而，禽類中負責精卵互作的輔助分子，包括在精子表面與ZP蛋白互作的活性組分仍有待研究。為此，我們制備了抗鵪鶉精細胞膜組分的單克隆抗體（Monoclonal Antibody，MAB）庫，并在體外通過精子檢測了MAB庫（成員）抑制卵周膜孔形成的能力。在MAB庫的上浮物中，我們發現上浮物19A16A13能強有力地阻止卵周膜孔的形成。對抗原使用串聯質譜分析表明MAB能識別精子頂體素（精子頭粒蛋白）。免疫組化分析和超微結構分析發現精子頂體素位于精子細胞質膜和頂體基質中。事實表明，MAB確能有效地阻止有完整頂體的精子與卵周膜結合。盡管精子頂體素ZP蛋白的結合能力還未知，但這些研究結果表明在鵪鶉受精過程中，精子質膜上分子量為45 kDa的精子頂體素有助于精子與卵周膜結合。

2 精子的頂體反應

某些組分，通過精子的細胞質膜和頂體外膜的融合，精子會釋放出頭部頂端的頂體泡內含物，此過程被稱為頂體反應（Acrosome Reaction，AR）。頂體反應使頂體內膜（Inner Acrosomal Membranes，IAM）暴露，IAM內的蛋白質如IZUMO 1蛋白被激活。不同動物頂體反應的誘導物不同。在海膽類生物中，當精子到達卵子外基膜（膠膜）時發生頂體反應，膠質中的海藻糖硫酸酯聚合物作為頂體反應的誘導物。在海星中，糖蛋白（頂體反應誘導物：Acrosome Reaction-Inducing Substance，ARIS）和甾體皂苷（ARIS輔助因子）的混合物或由34個氨基酸殘基組成的多肽Asterosap，均具有誘導頂體反應的潛能。類似的，非洲爪蟾輸卵管直段分泌的分子量為300 kDa的糖蛋白ARISX已被證實為其頂體反應誘導物，在小鼠和人中，孕酮具有誘導精子頂體反應的功能。人們普遍認為，頂體反應對釋放頂體基質內含物非常重要，釋放的精子頂體素能消化卵膜，形成便于精子穿透的通道。然而，最近多項研究發現，小鼠中大多數精子在到達透明帶前已完成頂體反應，且已經進入卵周隙的精子具有再次穿透透明帶的能力。從這些觀察結果來看，很顯然我們需要重新思考之前對哺乳動物受精過程中頂體反應作用的認識。

在禽類中，研究發現精子頂體反應的誘導活性發生在卵周膜中。雞卵周膜中的N-連接寡糖和末端N-乙酰葡萄糖胺殘基掌控著頂體反應誘導活性的證據來自十多年前的研究報道。然而，卵周膜中何種成分才是真正起作用的頂體反應誘導物，這在所有禽類中仍然未知。為了鑒定日本鵪鶉卵周膜中頂體反應的誘導物，我們建立了一種在顯微鏡下從頂體完整的精子中辨別發生頂體反應的精子的方法。由于煙酸己可堿（Hoechst）33342染色負性結構定位于精子核頂端，鵪鶉精子頂體可清晰地被檢測到（圖2）。通過這個方法，我們發現日本鵪鶉中卵周膜ZP1蛋白具有誘導頂體反應的活性，同時我們也證實了附著于ZP1蛋白上的N-連接寡糖在驅動頂體反應中起著重要的作用。與我們的研究結果相一致的是，Okumura及同事發現當采集的精子用純化的ZP1或ZPD蛋白（雞卵周膜中另一微量組分）共培養時，頂體反應可誘導發生。這些結果使我們確信禽類精子頂體反應的誘導發生在卵周膜表面，這與小鼠中的情況不同。

從介導頂體反應的信號轉導方面來看，研究表明哺乳動物精子的Gi蛋白參與此過程，因為百日咳毒素（Pertussis Toxin，PTX，Gi蛋白功能抑制劑），會抑制哺乳動物精子中ZP蛋白誘導的頂體反應。很有意思的是，有研究報道PTX并不會抑制人和小鼠精子中由孕酮誘導的頂體反應以及小鼠中乙酰膽堿誘導的頂體反應，這其實是一種PTX不敏感受體參與了頂體反應誘導過程。這些資料提示不同的生理刺激可利用不同的信號轉導通路來誘導精子頂體反應，不過雙重信號轉導系統存在的生理重要性仍有待解析。我們之前對日本鵪鶉的研究顯示，當PTX被加入培養混合物中時，ZP1和A23187蛋白誘導的頂體反應均受到明顯的抑制。這些結果表明ZP1或A23187蛋白可能通過Gi蛋白介導機制起作用，這類似于哺乳動物精子中透明帶啟動的精子頂體反應。

3 負責消化卵周膜的蛋白酶

雖然以上機制仍存在爭議，但人們普遍認為精子攜帶的蛋白酶能水解卵子外膜，由此蛋白酶形成的小孔為精子穿透提供通道。另外，人們長期以來一直認為：哺乳動物中的精子頂體素（即位于精子頭部的非ATP依賴性絲氨酸蛋白酶）在精子的穿透過程中是必不可少的。然而，Baba等的研究證明敲除頂體素的雄性小鼠仍能產生活動能力正常且具授精能力的精子。因此，至少對小鼠而言，精子頂體素對受精并不是必需的。目前，頂體素可以被認為負責分散頂體反應中精子頂體內含物。Sawada等報道在海生無脊椎動物如海鞘、海膽中，精子蛋白酶體負責精子穿透卵質膜。蛋白酶體是一種被稱為細胞溶解酶的溶解劑，它對溶解卵子外基質是不可或缺的。相似的結論可在小鼠、豬及人等哺乳動物的受精過程中獲得。

在禽類中，受精發生在輸卵管的漏斗部，在受精時僅卵周膜包裹著卵子。如上所述，禽類精卵互作是可以在體外依照精子在卵周膜上形成小孔的能力進行估量。通過抑制頂體反應，添加PTX，我們發現位于精子質膜上分子量為45 kDa的頂體素負責精子與卵子卵周膜的結合，但它對卵周膜糖蛋白的消化并不重要。這些結果表明：在禽類受精過程中真正起作用的細胞溶解酶不是頂體素，而是存在于精子中的另一蛋白酶。為了鑒定真正的禽類細胞溶解酶，我們之前曾檢測了精子蛋白酶體在日本鵪鶉受精過程中的作用，結果發現隨血液循環的ZP1蛋白在運輸至卵周膜過程中得到了某些修飾。這是從以下試驗獲得的結論：在對從產蛋鵪鶉血清中獲得的ZP1蛋白進行純化后，將其經靜脈注入不同禽類，外源性ZP1蛋白信號可以在卵周膜中檢測到。然而從卵周膜分離的ZP1蛋白還能不能進入到卵周膜。如前文所提到的，卵膜蛋白ZP1是禽類真正的頂體反應誘導物。我們也測試了血清ZP1蛋白是否也能誘導日本鵪鶉的頂體反應；結果發現兩種ZP1蛋白均能誘導頂體反應，但免疫印記分析表明抗泛素抗體只與卵周膜ZP1蛋白互作。這些結果表明血清ZP1蛋白在運輸過程中在細胞外受到泛素化作用，同時與ZP3蛋白結合并在卵周膜上形成不溶性纖維（圖3）。當血清ZP1蛋白或卵周膜ZP1蛋白在與精子共培養時，我們再次發現僅卵周膜ZP1蛋白被水解為小段肽鏈。利用抗20S蛋白酶體抗體的蛋白印跡（Western Blot，WB）分析和超微結構分析發現免疫反應性蛋白酶體位于精子的頂體區域。在培養混合物中添加特定的蛋白酶體抑制劑MG132，或通過添加三磷酸腺苷雙磷酸酶使細胞外ATP耗盡，均能有效抑制精子在卵周膜的穿透。這些結果清晰地證明了精子蛋白酶體在禽類受精中的重要作用以及ZP1的細胞外泛素化可能發生在經血液循環的運輸過程中（圖3）。盡管我們有很多研究證據顯示泛素-蛋白酶體系統對鵪鶉精子受精中在卵周膜上孔形成和之后精子穿透起卵周膜著重要的作用（圖4），但頂體素（即頂體絲氨酸蛋白酶）仍被確信為參與了受精過程中卵周膜孔的形成。正如在大多動物中研究所揭示的，泛素-蛋白酶體系統在動物受精中的作用可能是普遍保守的。其中，禽類泛素-蛋白酶體系統是研究受精過程中精子蛋白酶作用的有利模型，因為禽類精子能在卵周膜上形成一個較大的孔，且大量的靶蛋白ZP1可以從較大的卵子分離到。

大多數動物排出的卵子只接收一個精子形成合子，因為卵子內有一個阻斷系統以防止多精進入。最近對小鼠進行的研究發現，卵皮質顆粒蛋白酶Ovastatin對阻擋多精入卵是必不可少的；Ovastatin能部分水解ZP2蛋白，因而精子不會再與經Ovastatin修飾的透明帶互作。以非洲爪蟾的受精為例，當第一個精子進入卵子后不久，卵子質膜會迅速發生改變，通過誘發正向受精能力，來防止第二個精子的融合，以此迅速阻止多精入卵。與這些單精受精系統相比，禽類的卵子在受精過程中可以接受很多精子并進行多精受精。

這種生理情況表明在禽類受精過程中沒有阻止多精入卵的分子機制。我們最近在鵪鶉上利用胞漿內單精子顯微注射技術（Intra-Cytplasmic Sperm Injection，ICSI）證實了禽類多精受精是必要的，因為禽類較大的卵子需要更多能夠負責激活卵子和之后胚胎發育的精子。可以合理假設：缺乏阻止多精入卵的機制且需要大量精子因子激活大型卵子的這兩種現象是禽類在進化中獲得的能力。

4 結論

本文中我們介紹了近年來關于禽類精卵互作的研究成果。哺乳動物和禽類受精系統的比較如圖5所示。多種調控禽類受精的重要分子已被找到，但這主要是參照哺乳動物的研究而獲得的。因目前尚無通過轉基因技術獲得基因操作禽類的有效方法，有關禽類受精機制的知識還非常有限。我們最近的研究顯示利用ICSI技術能成功孵化出健康的小雞。用ICSI技術成功獲得健康雞對家禽業、農業及禽類保護（包括轉禽基因、克隆技術以及保護瀕危禽類）都有巨大的意義。結合ICSI技術和現代技術如CRISPR/Cas9系統，我們預期在不久的將來通過ICSI技術我們將能夠生產轉基因禽和基因敲除禽。我們也希望ICSI技術能幫助于我們了解禽類受精作用和胚胎發育機制的機制以及禽類生物學其他領域的知識。

原題名：Sperm-Egg Interaction during Fertilization in Birds（英文）

原作者：Yoshinobu Ichikawa、Mei Matsuzakil、Gen Hiyama、Shusei Mizushima和Tomohiro Sasanamil