美國紅楓組織培養技術的初步研究

【摘要】：本實驗以美國紅楓的帶芽莖段為外植體，分別采用75%酒精（15min）、0.1%升汞（5～8min）消毒，不同基本培養基（MS、WPM），激素種類及濃度等方面進行了研究。研究結果表明：最佳消毒處理為酒精15s+升汞6min，污染率為36.7%;外植體選用木質化莖段比半木質化莖段好，木質化莖段腋芽萌發率為半木質化莖段萌發率的3倍左右;PVP處理難以將外植體徹底消除褐化;啟動培養基MS優于WPM;啟動培養以MS+NAA0.25mg/L+6-BA1mg/L的效果較好;腋芽增殖的最佳培養基配方為：WPM+TDZ0.002mg/L+IBA0.1mg/L+IAA0.5mg/L+6-KT0.5mg/L，增殖率達到80%。

【關鍵詞】：美國紅楓;組織培養;外植體;褐化

1前言

美國紅楓（Acerrubrum），是槭樹科槭樹屬，別稱有紅花槭、北方紅楓、北美紅楓等，原產美國東海岸地區，主要生產地是美國北部及加拿大大部分地區。美國紅楓是北美紅楓與中國紅楓雜交并經過基因改良的的彩葉落葉大喬木[1]，美國紅楓是一種適用于群植、孤植及園林造景的優秀觀賞樹種[2]，在實際生產中，美國紅楓的繁殖限制了其廣泛的應用[3-6]。本試驗通過對美國紅楓的組織培養快速繁殖技術的初步研究，探索在美國紅楓組織培養過程中適合的外植體滅菌方法、外植體的選擇、篩選適合外植體生長的基本培養基、褐化抑制措施以及利于芽的增殖的激素種類和濃度，探索誘導愈傷組織分化的培養基，為進一步開展美國紅楓組織培養提供一定參考。

2材料與方法

2.1試驗材料

選用美國紅楓當年生枝條帶腋芽的莖段作為外植體。材料都取自于湖南農業大學。選擇一樹形優美健壯的母株，從同一母株的剪取當年生枝條，剪去葉片，帶1cm左右葉柄，外植體依腋芽剪成2.5～3cm小段，上端長1.5cm左右，下端長1.5～2cm左右，放入干凈的培養盒中，移置超凈工作臺備用。

2.2試驗方法

2.2.1外植體表面升汞滅菌時間篩選

外植體表面選用酒精、升汞消毒。75%酒精處理15s后，0.1%升汞+一滴吐溫處理1～10min，無菌水漂洗3～4次。消毒處理后將外植體放置在滅菌后的干燥無菌濾紙上，用消毒過后的解剖刀或手術剪刀將外植體依腋芽剪成2～2.5cm小段，上端長0.5cm左右，下端長1.5cm左右，葉柄0.5cm左右，接種于pH5.8～6.0的培養基上統計污染率、死亡率、存活率。

存活率（%）=存活的外植體數÷接種的外植體數×100%

污染率（%）=污染的外植體數÷接種的外植體數×100%

死亡率（%）=死亡的外植體數÷接種的外植體數×100%

2.2.2外植體取材種類的篩選

選取同一母株的當年生枝條，處理枝條過程中將帶腋芽的莖段剪去葉片修剪成2.5～3cm小段，并將修剪好的莖段分成木質化莖段和相對幼嫩的半木質化的莖段。將分好的兩種莖段在無菌操作臺上用75%酒精處理15s后，無菌水漂洗1～2次，0.1%升汞處理1～10min，無菌水漂洗3～4次進行消毒處理，剪成2～2.5cm小段。接種于pH值5.8～6.0的培養基上。統計存活率、死亡率、污染率。

2.2.3啟動培養基的篩選

在快速繁殖培養過程中，植物的材料，不同的實驗目的等所需的培養基都是不同的。本實驗分別選取WPM和MS兩種基本培養基，添加6-KT（1.0mg/L）、6-BA（0.5，1.0，1.5mg/L），NAA（0.125，0.25mg/L）將美國紅楓帶腋芽莖段接種于激素配比不同的培養基中，統計存活率和死亡率。

2.2.4腋芽增殖培養基的篩選

取在啟動培養基上啟動的腋芽接種于添加不同配比6-BA，NAA，TDZ，6-KT的以WPM為基本培養基的培養基中。并置于培養箱中培養，一段時間后統計本實驗中腋芽的存活并增殖率及死亡率。

3結果與分析

3.1外植體表面升汞滅菌時間篩選

消毒時間為5min時，污染率最高達到77.8%。而在超過7min時，外植體的存活率直線下降，直至8min時，外植體的存活率為0%。綜合以上，我們不難看出外植體用升汞消毒的最佳消毒時間是6min。在消毒時間為6min時，外植體的污染率及存活率最為合理。所以我們認為對于外植體消毒的最佳方式為：70%酒精消毒15s+0.1%升汞加一滴吐溫消毒6min+無菌水漂洗3～4次。

3.2外植體取材種類的篩選

木質化程度較高枝條健壯的外植體的腋芽萌發率比木質化程度低枝條細嫩的外植體的腋芽萌發率要高3倍左右。木質化莖段的腋芽比較飽滿健壯，萌發的枝條健壯，木質化程度低的半木質化莖段的腋芽比較幼嫩不夠飽滿，腋芽萌發需要更長時間，且萌發的枝條細嫩。

3.3啟動培養基的篩選

2號和4號培養基的對比，可以看出當各激素濃度一樣時，基本培養基為MS培養基時腋芽萌動率比WPM培養基的高8倍以上。隨著NAA濃度和6-BA濃度的提升，外植體腋芽萌動率會隨之提高，但是愈傷組織生長也會隨著濃度的提升而增加。因此綜合考慮，最佳啟動培養基為：MS+NAA0.25mg/L+6-BA1mg/L。

3.4腋芽增殖培養基的篩選

2號培養基和4號培養基的增殖率是1號和3號培養基增殖率的2-4倍，所以不難看出添加了IBA的培養基比沒有添加IBA的培養基腋芽增殖率要高，且2號培養基上的腋芽增殖率最高，增殖系數最大，達到80%的增值率，遠高于其他培養基配方。在觀察中我們發現2號培養基上增殖的腋芽長勢最好，萌芽健壯且數多。所以腋芽增殖的最佳培養基配方為：WPM+TDZ0.002mg/L+IBA0.1mg/L+IAA0.5mg/L+6-KT0.5mg/L。

3結論

在美國紅楓組織培養中選擇木質化莖段作為外植體的萌芽率要比半木質化莖段的萌芽率高3倍左右。最佳消毒處理為酒精15s+升汞6min，污染率為36.7%。啟動培養基MS優于WPM;啟動培養以MS+NAA0.25mg/L+6-BA1mg/L的效果較好。紅楓的愈傷組織分化僅僅依賴激素的調節是難以實現的;腋芽增殖的最佳培養基配方為：WPM+TDZ0.002mg/L+IBA0.1mg/L+IAA0.5mg/L+6-KT0.5mg/L。

參考文獻：

[1]李捷，王愛波.美國紅楓在我國的栽培管理現狀[J].商丘職業技術學院學報，2015，5（14）：105-106.

[2]董轉年，方樂金，等.紅楓的不同繁殖方法比較[J].湖南農業科學2011，（5）：114-115.

[3]葉景豐，尤文忠，馬冬菁，等.美國紅楓組織培養技術研究[J].遼寧林業科技，2014（4）：0035-0036.

[4]宗樹斌，周春玲，牛立軍，等.美國紅楓的組織培養研究[J].山東林業科技，2006（1）：1-3.

[5]金曉梅，張英，鐘敏.美國紅楓的高效繁殖[J].石河子科技，2015（08）：10-13.

[6]張健，李玉娟，李敏.典型彩葉樹種美國紅楓研究技術綜述[J]，廣西農學報，2009（4）：55-59