12個金針菇菌株菌絲的生長速度及胞外酶活力比較

摘要：主要比較了生產上常用的12個金針菇[Flammulina velutiper （Fr.） Sing.]菌株菌絲的生長速度及菌落特征，同時，對12個菌株的胞外酶，如羧甲基纖維素酶、木聚糖酶、漆酶的活力進行了測定，以期找出菌絲生長速度與胞外酶活力的相關性，為正確評價菌種質量提供科學依據。結果表明，12個菌株間菌絲生長速度存在差異，在PDA加富培養基上生長較快的菌株是9號和12號；在模擬出菇培養基上生長較快的菌株是7號、8號和12號。羧甲基纖維素酶活力最高的菌株是5號，木聚糖酶和漆酶活力最高的菌株是1號。胞外酶活力大小表現的順序與生長速度偶聯性較差。

關鍵詞：金針菇[Flammulina velutiper （Fr.） Sing.]；生長速度；羧甲基纖維素酶；木聚糖酶；漆酶

中圖分類號：S646.1+5∶Q55 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）22-5849-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.032

Study on the Hypha Growth Speed and Extracellular Enzymes Activity of 12 Strains of Flammulina velutiper

ZHAO Shu-ying1，WANG Li-an2

（1. College of Physical Education， Cangzhou Normal University， Cangzhou 061001， Hebei， China；

2. College of Life Science， Hebei Normal University， Shijiazhuang 050021， China）

Abstract： The hypha growth speed and colony characteristics of 12 stains of Flammulina velutiper （Fr.） Sing commonly used on the production was compared. Moreover， the activity of their extracellular enzymes， such as Carboxymethyl cellulose， xylanase， laccase enzyme were determined in order to find out the relationship between hypha growth rate and extracellular enzyme activity so as to provide scientific basis for evaluation of strain quality. The experimental results show that the growth speed of strain No.9 and No.12 was faster than the others on PDA medium with rich inorganic salts and vitamin； while the growth speed of strain No.7， No.8， and No.12 was faster than others on simulated mushroom medium. Carboxymethyl cellulase is the most active in strain No.5； while xylanase and laccase is the most active in strain No.1. The contingency between extracellular enzyme activity and speed coupling is poorer.

Key words： Flammulina velutiper （Fr.） Sing.； growth speed； CMC cellulose； xylanase； laccase

金針菇[Flammulina velutiper（Fr.）Sing.]是味道鮮美、營養豐富的食用菌之一，同時又具有良好的保健價值，在國內許多地區都有栽培，金針菇產業的發展對促進當地經濟和社會發展起到了重要推動作用。但在金針菇生產上也出現一些問題，一是所用金針菇菌種普遍退化、老化，造成菇農栽培風險加大，經濟效益下滑；二是金針菇菌種市場極為混亂。由于目前食用菌菌種質量評價的科學體系還不完善，菌種質量和產銷管理薄弱，一定程度上造成了食用菌菌種雜、多、亂的混亂現象，嚴重損害了菇農利益。為了解決以上問題，試驗選擇12個金針菇菌株為材料，通過測定胞外酶活力，試圖建立快速評價菌種質量的檢測體系，即找出胞外酶活力與生長速率的內在聯系，從而建立不同菌株的酶活力數據庫來評價菌種質量，為金針菇菌種質量保障提供技術支撐。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

12個不同金針菇菌株均為當地金針菇主栽菌種，現保存于河北師范大學生命科學學院實驗室。具體編號為1號：白金F21；2號：金針FV093；3號：金針1008；4號：金科佳2041；5號：金針日金1號；6號：金F39；7號：金針1301；8號：金針2102；9號：三明B；10號：金雜19；11號：福建白金針；12號：三明C。

主要儀器有756MC紫外可見分光光度計、電熱恒溫水浴鍋、恒溫培養箱、超凈工作臺、電磁爐、電子分析天平、RE-5203旋轉蒸發器、振蕩器、78-1磁力加熱攪拌器、立式自動電熱蒸汽滅菌器等。

胞外酶活力測定的主要試劑有3，5-二硝基水楊酸（DNS，顯色劑）、醋酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.6）、鄰聯甲苯胺、木聚糖溶液，底物為1%的羧甲基纖維素鈉溶液。

1.2 菌種培養

1.2.1 培養基 分別制作PDA培養基、PDA加富培養基、模擬出菇培養基。

1.2.2 不同菌株菌絲生長速度的測定 將4 ℃冰箱保存的試管母種分別接種到PDA加富培養基平板上，25 ℃下培養7 d后備用[1]。將活化的菌絲沿菌落的邊緣用打孔器切下直徑8 mm的菌塊，分別接種于PDA加富培養基平板及模擬出菇培養基平板上，每個菌種3次重復，于25 ℃恒溫培養箱內培養，2 d后每天定時精確測量菌落半徑，同時觀察記錄菌株的菌落形態，按下式計算菌絲生長速度[2]，

菌絲生長速度（mm/d）=菌落半徑（mm）/菌絲生長天數（d）。

1.3 胞外酶活力測定

1.3.1 酶液的制備 將在模擬出菇培養基上培養的菌落沿菌落邊緣挖取發菌料各1 g于試管中，加入0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液10 mL（pH 4.6），4 ℃浸提4 h；將浸提液用濾紙過濾即得粗酶液。用于測定羧甲基纖維素酶、木聚糖酶、漆酶活力，測定時將各酶液稀釋10倍[3]。

1.3.2 羧甲基纖維素酶活力測定 參考文獻[4]的方法。①葡萄糖標準曲線的制備，準確稱量0.1 g葡萄糖，加去離子水定容至100 mL，配成濃度為1 mg/mL的葡萄糖標準溶液，然后按照表1中不同的梯度進行稀釋，制成梯度溶液。每試管分別取樣2.5 mL，分別加2.5 mL DNS置于沸水浴5 min后顯色，冷卻后，于紫外可見分光光度計530 nm處測OD值。以OD值為縱坐標，葡萄糖質量為橫坐標做標準曲線，求出回歸方程。②羧甲基纖維素酶活力的測定，將1%的羧甲基纖維素鈉溶液與稀釋后的粗酶液在50 ℃預熱1～2 min，在試管中依次加入預熱后的2.0 mL 1%的羧甲基纖維素鈉溶液和0.5 mL稀釋后的粗酶液，50 ℃水浴30 min，取出后立即加入DNS試劑2.5 mL，100 ℃水浴中保溫5 min，取出后用冷水冷卻，于530 nm處測OD值，對照管加DNS試劑后再加相應酶液，每組設1個對照、2次重復。酶活力以樣品與底物反應30 min后的光密度改變值表示。羧甲基纖維素酶活力單位定義為在50 ℃、pH 4.6條件下，反應30 min，每分鐘每毫升羧甲基纖維素酶催化纖維素類物質水解生成1 μg葡萄糖的酶量定義為1 U。按下式計算酶活力，

羧甲基纖維素酶活力=N×葡萄糖的生成量/30/0.5×2.5，

式中，N為固體原料加水浸提所得的酶液稀釋倍數，葡萄糖的生成量從標準曲線中查出，30表示酶促反應的時間（min）；0.5代表反應中加的酶量（mL）；2.5為反應的總體積（mL）。

1.3.3 木聚糖酶活力的測定 木聚糖酶活力為各菌株在模擬出菇培養基上生長第八天所測得，參考文獻[5]的方法，先將pH 4.6的醋酸鈉緩沖溶液、1%的木聚糖溶液及粗酶液于40 ℃預熱1～2 min；然后在試管中依次加入pH 4.6的醋酸鈉緩沖溶液1 mL、1%的木聚糖溶液0.5 mL、稀釋后的粗酶液0.5 mL，40 ℃水浴30 min；取出后立即加入DNS試劑3 mL，100 ℃水浴中保溫5 min，取出后用水冷卻，于510 nm波長處測OD值。對照管加DNS試劑后再加相應的酶液，每組設1個對照、2次重復。酶活力以樣品與底物反應30 min后吸光度的改變表示。木聚糖酶活力單位定義為在40 ℃、pH 4.6條件下，反應30 min，每分鐘每毫升木聚糖酶催化底物產生0.1吸光度的變化為1 U。按下式計算木聚糖酶活力，

木聚糖酶活力=N×OD值/30/0.5/0.1，

式中，N為固體原料加水浸提所得的酶液稀釋倍數；30表示酶促反應的時間（min）；0.5代表反應中加的酶量（mL）；0.1為吸光度的變化數值。

1.3.4 漆酶活力的測定 漆酶活力為各菌株在模擬出菇培養基上生長第八天所測得，參考文獻[6]的方法，先將3.36 mmol/L鄰聯甲苯胺溶液、pH 4.6 的醋酸鈉緩沖溶液及粗酶液于28 ℃預熱1～2 min；然后往試管中依次加入3.36 mmol/L鄰聯甲苯胺溶液0.5 mL、pH 4.6的醋酸鈉緩沖溶液3.5 mL、0.5 mL粗酶液，28 ℃保溫30 min后，以煮沸滅活的酶液作對照，600 nm處測OD值，每組設1個對照、2次重復，酶活力以樣品與底物反應30 min后吸光度值的改變表示。漆酶活力單位定義為在28 ℃、pH 4.6條件下，反應30 min，每分鐘每毫升漆酶催化底物產生0.1個吸光度的變化為1 U。按下式計算漆酶活力，

漆酶活力=N×OD值/30/0.5/0.1，

式中，N為固體原料加水浸提所得的酶液稀釋倍數；30表示酶促反應的時間（min）；0.5代表反應中加的酶量（mL）；0.1為吸光度的變化數值。

1.4 數據處理

試驗所得數據采用Microsoft Office Excel 2003軟件處理，并用其制表和繪圖，運用SPSS 13.0統計分析軟件進行方差分析和差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 12個金針菇菌株的菌絲生長特性比較

12個金針菇菌株在PDA加富培養基及模擬出菇培養基上的菌絲生長速度及生長狀況測定結果分別見表2、圖1、圖2，在PDA加富培養基上的菌絲生長速度方差分析結果見表3，在模擬出菇培養基上的菌絲生長速度方差分析結果見表4。從表2、表3、表4、圖1、圖2分析可知，在PDA加富培養基上，12個金針菇菌株的菌絲生長速度可分為4組， A組有9號和12號菌株，B組含10號、7號、3號、11號、8號、5號，C組為1號；D組為6號、2號和4號，生長速度總體趨勢為A>B>C>D。各組的方差分析結果表明，A組和B組菌絲生長速度之間無顯著差異（P>0.05），同屬生長較快的菌株；C組與B組菌絲生長速度相比無顯著差異（P>0.05），但卻顯著低于A組（P<0.05）；D組菌絲生長速度較慢，且與A、B、C組差異顯著（P<0.05）。在PDA加富培養基上總方差分析結果顯示，F=18.72，P=0.000 000，P<0.05，說明不同菌株在PDA加富培養基上的生長速度存在顯著差異。在模擬出菇培養基上，12個金針菇菌株的菌絲生長速度可分為5組，A′組是12號和8號，B′組含7號、10號、6號、9號、4號、3號、5號，C′組有1號；D′組有2號，E′組有11號。生長速度的總體趨勢是A′>B′>C′>D′>E′。各組的方差分析結果表明，A′組和B′組之間無顯著差異（P>0.05），同屬生長較快的菌株；C′組和B′組之間無顯著差異（P>0.05），但要顯著低于A′組（P<0.05）；D′組和C′組之間無顯著差異（P>0.05），但卻顯著慢于A′組和B′組（P<0.05）；E′組菌絲生長速度要顯著慢于A′組、B′組、C′組和D′組（P<0.05）。在模擬出菇培養基上總方差分析結果顯示，F=12.981，P=0.000 000，P<0.05，說明不同菌株在模擬出菇培養基上的生長速度存在顯著差異。

2.2 12個金針菇菌株的纖維素酶活力

2.2.1 葡萄糖標準曲線 以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，做葡萄糖標準曲線，結果見圖3。從圖3可以看出，吸光度在0.2～1.4時，與葡萄糖濃度呈線性關系。統計分析結果顯示，在95%的置信區間內，其回歸方程為y=0.008 1x-0.253 5，R2=0.998 425，說明可用于糖的測定。

2.2.2 12個金針菇菌株的羧甲基纖維素酶活力 12個金針菇菌株的羧甲基纖維素酶活力測定結果見表5、圖4。由表5、圖4可以看出，12個金針菇菌株的羧甲基纖維素酶活力由大到小的排序依次為5號、1號、7號、4號、9號、3號、8號、2號、12號、6號、10號、11號。以5號菌株的羧甲基纖維素酶活力最高，為175.41 U，與其他11個菌株的酶活力差異顯著（P<0.05）；11號菌株的羧甲基纖維素酶活力最低，為123.56 U，與其他11個菌株的酶活力差異顯著（P<0.05）。

2.3 12個金針菇菌株的木聚糖酶活力

12個金針菇菌株的木聚糖酶活力測定結果見表5、圖5。由表5、圖5可以看出，12個金針菇菌株的木聚糖酶活力由大到小的排序依次為1號、2號、12號、11號、9號、4號、3號、5號、7號、10號、6號、8號。以1號菌株的木聚糖酶活力最高，為3.60 U，除2號菌株外，與其他10個菌株的酶活力差異顯著（P<0.05）；8號菌株的木聚糖酶活力最低，僅為0.76 U，除6號、7號、10號菌株外，與其他8個菌株的酶活力差異顯著（P<0.05）。

2.4 12個金針菇菌株的漆酶活力

12個金針菇菌株的漆酶活力測定結果見表5、圖6。由表5及圖6可以看出，12個金針菇菌株的漆酶活力由大到小的排序依次為1號、2號、9號、4號、12號、6號、11號、8號、5號、7號、10號、3號。以1號菌株的漆酶活力最高，為3.39 U，與其他11個菌株的酶活力差異顯著（P<0.05）；3號菌株的漆酶活力最低，僅為1.09 U，與其他11個菌株的酶活力差異顯著（P<0.05）。

3 小結與討論

試驗結果顯示，12個金針菇菌株的菌絲生長速度在PDA加富培養基和模擬出菇培養基上基本是一致的，形態特征也無明顯差異。在PDA加富培養基和模擬出菇培養基上均表現為生長較快的菌株有9號、12號、10號、7號、3號、8號、1號、5號、6號。所以可以用在PDA加富培養基上生長較快作為判斷菌種吃料能力的評價指標。另外從反映菌株吃料能力的胞外酶活力測定情況看，羧甲基纖維素酶、木聚糖酶、漆酶活力均較高的菌株只有1號，并且其生長速度也較高，可判斷為優良菌株；9號、12號各項指標也表現較好，也可視為優質菌種[7]。

試驗的初衷是建立金針菇不同菌株的質量評價體系，所以搜集的菌種均為各地的高產主栽菌種。從試驗結果可以看出，大多數金針菇菌株在PDA加富培養基和模擬出菇培養基上的生長速度均較快，說明參試菌株多數品質優良。此外，試驗通過測定胞外酶活力試圖建立快速評價菌種質量的檢測體系，即找出胞外酶活力與生長速度的內在聯系，通過建立不同菌株的酶活力數據庫來評價菌種質量。但試驗結果顯示，還有很多問題需要進一步探討，如有的菌株在2種培養基上的生長速度不一致，如11號在PDA加富培養基上生長的速度較快，但在模擬出菇培養基上生長最慢；還有就是胞外酶活力大小的順序與生長速度偶聯性較差，如2號菌株為生長速度較慢的菌株，但其木聚糖酶、漆酶的活力卻較高。

為了克服誤差，試驗進行了多次重復，但仍存在這些問題。可能的原因一是參試的菌株菌齡不一致，由于參試材料來自各地，菌齡已無從查考。但一個明顯的事實是菌株的生長速度與菌株的傳代次數相關，傳代次數越多，菌株生長能力越弱；菌株生長速度與菌株的適應能力也有關，從一種培養基到另一種培養基，菌株需要有一段適應時間，培養基成分相差越大，菌株生長速度就越慢。從試驗結果看出，相同的菌株在不同的培養基上生長速度不同，不同的菌株在相同的培養基上生長速度也不同。整體上比較，菌株在PDA加富培養基上的生長速度高于在模擬出菇培養基上的生長速度。PDA加富培養基較模擬出菇培養基有更豐富的碳、氮源。為此，下一步的研究應注意采用相同菌齡的材料來對比。可采用先對參試材料進行品比試驗，再采用組織分離方法重新分離菌種，以使菌齡達到一致。二是胞外酶屬于誘導性酶，酶活性的高低與培養基的基質有關。為了比較不同菌株的吃料能力，試驗采用了模擬出菇培養基測定3種胞外酶活力。羧甲基纖維素酶的作用是分解纖維素，木聚糖酶有分解半纖維素的能力，漆酶能催化木質素類的氧化酚類和芳香類化合物。試驗采用的方法比一般的利用菌袋比較更利于在實驗室培養及取材；但從酶活力結果看，結果并不理想。可能的原因是酶測定方法本身的誤差造成，因在測定過程中參考有關文獻方法時，發現酶活力數據漂移較大，如在測各種菌株漆酶的活力時，若將反應溫度升高至50 ℃后，液體顏色為綠色，這與文獻報道的產物為藍綠色不同；懷疑為產物有所改變，故將測漆酶活力的溫度固定為28 ℃。所以，建立穩定的、標準化酶活力檢測方法將是下一步的重點。

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