不同鉀鈉比的查氏培養基對大麗輪枝菌生物學性狀及致病力的影響
2016-04-29 00:00:00黃薇袁斌萬鵬金利容黃民松
湖北農業科學 2016年22期
摘要：研究了大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）在不同鉀鈉比（K+/Na+）的查氏培養基中生長的生物學特性及致病力的變化。結果表明，菌株在0
關鍵詞：查氏固體培養基；鉀鈉比（K+/Na+）；微菌核；致病力
中圖分類號：S432.4+4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）22-5815-06
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.022
The Influence of Different Ratios of K+/Na+ in Czapek’s Medium to Biological Characters and Virulence of Verticcilium dahilae
HUANG Wei， YUAN Bin， WAN Peng， JIN Li-rong， HUANG Min-song
（Institute of Plant Protection and Soil Fertilizer， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）
Abstract：The biological characteristic and virulence of Verticcilium dahilae strains were observed and recorded of strains on Czapek’s solid medium with different ratio of K+/Na+. The results showed that the growth rates of strains were signifcantly different when the ratio of K+/Na+ were less than or equal to 5.248， however， there were no signifcant differences when the ratio of K+/Na+ were greater than 5.248. The growth curves appeared M-form when the ratio of K+/Na+ less than or equal to 5.248， and appeared W-form when the ratio of K+/Na+ greater than 5.248. The yield of microsclerotia（MS） was biggest while the ratio of K+/Na+ was less equal to 5.248， but microsclerotia aslo exsited in the solid meddium which lacking of potassium. It showed that potassium affected the formation of microsclerotia，it would obviously improve the yield of microsclerotia in the appropriate content， but it was not necessarily produce factors. K+ concentration would affect the pathogenicity of strains， when the ratio of K+/Na+ were less than or equal to 2.624， by increasing K+ concentration， the pathogenicity of strains were enhanced. When the ratio of K+/Na+ was equal to 26.24， K+ concentration was very high， the pathogenicity of strain was weakened. In the case of the same K+ concentration， the virulence of strains had positive correlation with Na+ concentration. Increasing the concentration of Na+， the ratio of K+/Na+ was decreased，and the pathogenicity of strains was increased and vice versa.
Key words： Czapeks’solid medium； ratio of K+/Na+； microsclerotia； pathogenicity
棉花的黃萎病為一種土傳性病害，致病菌有大麗輪枝菌（Verticillium dahilae）和黑白輪枝菌（V. alboatrum）[1]，早在20世紀90年代，張緒振等[2]研究發現，中國棉花黃萎病的致病菌主要為大麗輪枝菌。大麗輪枝菌的寄主范圍廣，目前已達到660多種，且該病原菌的變異程度高，產生的微菌核的抗逆性非常強，可在土壤中存活超過10年[2]，是棉花上的一種主要病害[3，4]，在中國的四大棉區都存在著較大的影響，目前尚未找到能夠控制該病害發生的有效措施。
筆者在進行菌株的致病力測定時，從華中農業大學張獻龍實驗室得到了一株純合的對照菌株V991，培養性狀為黑色菌核型，致病力強。經過多次繼代培養后，角變得到一株白色的菌株，為菌絲型，氣生菌絲茂盛，經查氏培養基接種后致病力明顯弱于V991，但其性狀可以得到穩定的遺傳。經過rDNA-ITS分子鑒定發現弱毒株和強毒株的DNA序列完全相同，但生物學特性及致病力完全不同。
由于大麗輪枝菌的變異性非常強，在常規的PDA培養基上極易發生變異，經過多次繼代培養后，菌株的致病力也會發生減退。PDA培養基作為一種半合成培養基，用于產孢或擴繁菌種較適合，但不適于研究培養條件對菌株的影響。查氏培養液作為組分已知的一種培養基，常用于黃萎病菌的擴大培養，繼而對鑒別寄主進行根部接種。真菌的生長需要鉀，在叢生真菌中，缺鉀和鉀過量對真菌的生長都不利[5]。而且胞內K+的大量積累對維持有機體的正常功能至關重要，K+的丟失會導致多種代謝途徑如糖酵解和呼吸作用等受阻[6]。查氏液體培養基中鉀、鈉含量和鉀鈉比（K+/Na+）是已知的，因此本試驗通過調整其中的K+/Na+，對培養基組分進行改進，用于培養菌株，觀察并記錄其生理生化特性以及菌株的致病性，闡明培養基中K+、Na+及其比值變化對目的菌株的影響，以及它們與菌株致病性的關系，為病原菌的致病機理提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 供試菌株
大麗輪枝菌菌株V991b（Vb），白色突變株V991w（Vw），由華中農業大學實驗室提供；對照菌株Ay，由中國農業科學院棉花研究所提供。
1.2 不同培養基對大麗輪枝菌生物習性的影響
1.2.1 試驗設置 試驗設置以常規的查氏液體培養基為基礎，鈉鹽和鉀鹽的用量及鉀鈉比見表1，其中無鈉培養基CA6以等摩爾的硝酸鉀代替硝酸鈉；無鉀培養基CA7以等摩爾的磷酸氫二鈉代替磷酸氫二鉀，以等摩爾的氯化鈉代替氯化鉀。其余成分均不變，分別為蔗糖30.00 g、硫酸鎂0.50 g、硫酸亞鐵0.02 g、瓊脂15.00 g、去離子水1 000 mL。常規的查氏培養液的成分參見文獻[6]，為減少沉淀將磷酸鹽分別滅菌，冷卻后在無菌條件下加入到培養基中[7]，其中K+/Na+為1.312∶1。
1.2.2 調查內容及方法 病原菌接種于PDA培養基上培養5 d，沿菌落外緣打孔，菌餅直徑5 mm。再轉接到不同K+/Na+ 的查氏固體培養基中，分別標記為CA1、CA2、CA3、CA4、CA5、CA6、CA7、CK，置于（25+1） ℃培養箱中黑暗靜置培養，每隔1 d觀察菌落生物學性狀并用十字交叉法測量菌落直徑。調查菌落質地、菌落形成特征、菌落顏色、色素有無、培養溫度、培養基類型、測量時間和菌株生長速率，培養15 d后，結束調查。
1.3 不同培養基培養對大麗輪枝菌致病力影響的測定
1.3.1 接種病原菌的制備 參照“1.2.1”中的查氏培養基的成分，依次稱重，將培養液100 mL裝入250 mL三角瓶內，121 ℃、0.103 MPa條件下滅菌30 min。然后將在PDA平板中生長15 d的供試菌株用0.7 cm的打孔器打成菌碟，接入到查氏液體培養液中，在25 ℃黑暗條件下，120 r/min振蕩培養15 d。
1.3.2 棉苗的致病力測定 種子經硫酸脫絨后，每個品種挑選飽滿的棉種，播種前用70%的乙醇浸泡5 min，用5%的H2O2浸泡2 h，無菌水沖洗2～3遍。采用無土基質育苗技術育苗，將棉子播下[8]。保證苗床的濕度和溫度，培養棉苗25 d至2～3片真葉時，即可接種。取每個品種60株棉苗，保持根部基本整齊一致，置于同一菌系的菌液中，使根充分接觸菌液。裸苗浸根接種30 min，后移栽至營養缽中。在網室內放置最低最高溫度表，記載每天的溫度狀況，均溫26 ℃左右。觀察和記錄病害的發生情況，分別于15、20、25 d調查發病率及病情指數。
1.3.3 數據分析 采用DPS 5.0單因素方差分析和Duncan’s新復極差測驗的多重比較分析試驗數據。
2 結果與分析
2.1 不同處理條件下培養基對不同菌株生物學性狀的影響
不同處理條件下，對病原菌的培養性狀表型的影響如圖1、圖2所示。
由圖1可知，Vb在低鉀至高鉀查氏固體培養基中均出現微菌核，但微菌核數量上有一定差異。從形態上看，無鉀培養基上的菌落中的氣生菌絲均勻分布于菌落表面，微菌核數量多，但生長受到了明顯的抑制。不同鉀鈉比的查氏固體培養基上的Vb菌株氣生菌絲明顯減少，且菌絲非常稀疏，零星散布于菌落表面。
由圖2可知，Vw在低鉀至高鉀查氏固體培養基上均無微菌核產生，氣生菌絲在菌落表面均有分布，在不同鉀鈉比的查氏固體培養基上Vw菌株氣生菌絲較短，且稀疏很多，僅在菌落表面產生很薄的一層菌絲。無鉀條件下，Vw菌落生長抑制明顯，幾乎無氣生菌絲，整個菌落呈膜狀。
2.2 不同鉀離子濃度對菌核型菌株微菌核數量的影響
由表2可知，K+濃度高低對微菌核的產生有影響，K+/Na+為5.248的固體培養基條件下，Vb的微菌核產量最大，整個菌落都呈黑色，且對菌株的生長無顯著影響。無鉀處理中，菌落中同樣存在微菌核，但菌落直徑明顯低于其他處理，只相當于其他處理菌株生長直徑的40%左右。說明在真菌生長過程中鉀離子對真菌生長有較大影響，對微菌核的產生也有影響，但非必要影響因素，在K+/Na+為5.248的固體培養基條件下，K+濃度對微菌核產量的影響最大。
2.3 不同K+/Na+的查氏固體培養基對Vb顯微結構的影響
不同K+/Na+的查氏固體培養基對Vb和Vw的形態學影響如圖3所示，主要表現在氣生菌絲的濃密稀疏程度及培養基上菌絲的數量和微菌核的數量上。但從低鉀到高鉀培養基，Vb均能產生微菌核，對分生孢子大小、菌絲的分隔和微菌核的微觀結構影響不大；Vw的微觀形態與常規PDA上無明顯差異，但無鉀培養基對真菌產孢量影響較大，產孢量明顯下降，菌絲體含量也明顯下降。
2.4 不同K+/Na+的查氏固體培養基對菌核型菌落產生微菌核時間的影響
由表3可知，25 ℃條件下，Vb在不同K+/Na+的查氏固體培養基上均能產生微菌核，CA1、CA2、CA3、CA5、CA7、CK的微菌核出現在接種后3 d，CA4與CA6的微菌核出現在接種后5 d，培養皿上均有明顯的微菌核結構。30 ℃條件下，低K+/Na+固體培養基上未見微菌核結構，K+/Na+為20.992以上的固體培養基上有部分出現微菌核，但總體上微菌核較少。
2.5 不同K+/Na+的查氏固體培養基對菌落生長速率的影響
在25 ℃條件下，從不同K+/Na+ 的查氏固體培養基菌落生長速率（表4、圖4）可以看出，菌落生長 7 d達到最快生長速率。平均生長速率約10 mm/d。CA7為無鉀培養基。從菌落直徑上看，無鉀培養基上菌株生長速率顯著低于其他培養基，說明在真菌生長過程中，無鉀條件會顯著影響菌株生長直徑。
在30 ℃條件下，除無鉀培養基CA7外，其他不同K+/Na+的查氏固體培養基的菌落生長速率無顯著差異，可能是高溫導致菌落的生長速度降低，使菌株之間的生長速率差異不顯著。生長前期強弱毒株菌落的生長速率差異不明顯，生長后期弱毒株Vw菌落生長速率高于強毒株Vb，說明Vw對高溫的耐受力強于Vb。從接種2周的菌落生長速率曲線可以看出，生長前中期，Vb生長快于Vw，靜置培養2周后，Vw生長速率反而高于Vb（表5、圖5）。
2.6 不同K+/Na+查氏固體培養基對菌落直徑的影響
靜置培養15 d，不同K+/Na+查氏固體培養基上的菌落直徑有一定的差異。對照CK查氏固體培養基上的菌落直徑最大。在25 ℃條件下，高毒Vb菌株在低鉀培養基與高鉀培養基之間差異顯著，高毒Vb和低毒Vw菌株均與無鉀處理CA7差異極顯著。高毒Vb和低毒Vw在25、30 ℃條件下，無鉀處理CA7與其他處理間均差異極顯著，說明無鉀條件下，Na+能夠明顯抑制真菌的生長，而無鈉條件下，K+能夠基本滿足真菌生長的需求，彌足Na+的缺失，使得真菌生長水平接近對照CK（表6、表7）。
2.7 不同K+/Na+查氏液體培養基搖菌后對菌株致病力的調查
在溫室條件下，將棉苗分成3組，進行組間顯著性比較。3種鑒別寄主15dpi、20dpi、25dpi的病指結果見表8。
由表8可知，與對照CK相比，當K+/Na+在較低水平時，隨著K+濃度的上升，菌株的致病力有所增強，CA1處理中，強毒株Vb和弱毒株Vw的病指均高于對照CK的病指。當鑒別寄主接種25 dpi時，Vb-CA1的病指（63.35）高于Vb-CK的病指（57.14）；Vw-CA1的病指（25.51）與Vw-CK的病指（26.88）相當。當K+/Na+高于20以上時，菌株的致病力隨著K+濃度的升高而增強。
無Na+處理中菌株的致病力有小幅度下降，Vb-CA6在鑒別寄主接種15 dpi、20 dpi和25 dpi時的病指依次為19.07、38.50、56.99，而Vb-CK的病指依次為13.99、40.62、57.14；Vw-CA6在鑒別寄主為15 dpi、20 dpi、25 dpi時的病指依次為2.13、7.81、16.86，而Vw-CK的病指依次為4.94、14.76、26.88。
無K+處理中菌株的致病力明顯低于對照菌株，Vb-CA7在鑒別寄主為15 dpi、20 dpi、25 dpi時的病指依次為15.39、32.04、44.93，而Vw-CAT的病指依次為3.19、8.15和14.05，分別低于Vb-CK、Vw-CK。
在K+濃度不變的條件下，Na+與病原菌的致病力初步呈正相關，Na+濃度升高，K+/Na+降低，病原菌的致病力表現為上升，Vb-CA1在鑒別寄主為15 dpi、20 dpi、25 dpi時的病指分別為20.20、47.37、63.35，均高于Vb-CK；Vw-CA1在鑒別寄主為15 dpi、20 dpi、25 dpi時的病指分別為7.51、20.47、25.51，高于或近于Vw-CK；而當Na+濃度下降，K+/Na+比上升，病原菌的致病力表現為下降。在CA3與CA4處理中，Vb-CA3在鑒別寄主為25 dpi時的病指為58.82，明顯高于Vb-CA4；Vw-CA3在鑒別寄主為25 dpi時的病指為28.02，高于Vw-CA4，但差異不顯著。
3 小結與討論
通過對不同K+/Na+查氏固體培養基對菌株生物學特性的研究，結果表明，不同K+/Na+培養條件對同一菌株的形態學無影響，但對同一菌株氣生菌絲和微菌核的數量有影響。強毒株V991b的微菌核產量最大是在K+/Na+為5.248的查氏固體培養基上，并且高于對照CK，但在無K+條件下同樣有微菌核的產生。說明K+濃度對微菌核的產生有一定影響，但非產生微菌核的必要影響因素，在K+濃度適中情況下會增加菌株微菌核的產量。
與25 ℃相比，30 ℃條件下不同培養基上微菌核數量有明顯的下降，說明高溫對微菌核的影響比培養基成分的影響更大。高溫會抑制微菌核的產生，這與白應文等[9]對輪枝孢微菌核特性的研究一致。
無K+條件下，25、30 ℃處理下強毒株Vb和弱毒株Vw的生長明顯受到抑制。培養皿的背面Vb中的微菌核明顯可見，氣生菌絲稀疏且均勻散布在菌落表面；Vw菌落表面幾乎無氣生菌絲，整個菌落呈膜狀。說明在無K+條件下，Na+能夠明顯抑制真菌的生長，而無Na+條件下，K+能夠基本滿足真菌生長的需求，彌足Na+的缺失，使得真菌生長水平與對照CK基本相當。
與對照CK相比，當K+/Na+在較低水平時，隨著K+濃度的上升，菌株的致病力有所增強，在CA1處理中，強毒株Vb和弱毒株Vw的病指均高于對照CK的病指。當K+/Na+高于20時，菌株的致病力依然會隨著K+濃度的升高而增強。而無K+處理中菌株的致病力明顯低于對照菌株，隨著接種時間的延長，這種差異性更顯著。
強毒和弱毒菌株造成致病力差異的原因有可能與菌株對鑒別寄主的侵染力或病原菌在植株體內的繁殖速度有關。通過不同營養來源的培養基對強毒和弱毒菌株進行致病力測定發現，使用常規查氏培養基搖菌后，病原菌的致病力最高，而以棉葉組織為營養來源的培養基搖得的菌株致病力最低，大部分植株均處于未發病狀態。這可能與植物營養培養基對病原菌菌株進行了“減毒”有關，該現象已經在番茄上發現類似的表現[10]。但強弱菌株致病力差異究竟是由于病原菌的初侵染能力不同導致的，還是病原菌在植物體內的繁殖速度的不同導致的，還有待于進一步的驗證。
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