響應面法對苦櫧果實中黃酮提取工藝的優化

摘要：為研究苦櫧（Castanopcis sclerophylla）果實中黃酮的提取工藝，利用單因素試驗及響應面分析法，探討了乙醇體積分數、料液比、提取溫度和提取時間對苦櫧果實黃酮提取量的影響。結合響應面交互作用，分析優化得出苦櫧果實中黃酮的最佳提取條件為：乙醇體積分數50%，料液比1∶36（g∶mL），提取時間2.5 h，提取溫度83 ℃。在此條件下黃酮提取量實測值可達2.107 mg/g，與預測值（2.091 mg/g）相吻合。

關鍵詞：苦櫧（Castanopcis sclerophylla）；黃酮；響應面法；提取工藝

中圖分類號：S792.17；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）22-5911-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.046

Study on the Extraction Technology of Flavonoids from Sclerophylla

Fruit by Response Surface Methodology

ZHOU Xian-jiaoa，b，CHEN Qiu-yua，b，CHEN Ronga，b，PAN Jin-quana，b，RAO Ying-zhua，b

（a.Life Science and Technology School；b.Institute of Applied Biotenology，Lingnan Normal University，Zhanjiang 524048，Guangdong，China）

Abstract： In order to study the extraction technology of flavonoids from Sclerophylla fruit，using THE single factor experiment and response surface methodology to investigate the impacts of ethanol volume fraction，solid-to-liquid ratio，extraction temperature and extraction time on the extraction rate of flavonoids from Sclerophylla fruit. Combined with the response surface interaction，the optimum extraction conditions of flavonoids from Sclerophylla fruit were an ethanol volume fraction of 50%，the solid-to-liquid of 1∶36 g/mL， extraction time of 2.5 h and extraction temperature of 83 ℃. Under these conditions the measured extraction rate of flavonoids was 2.107 mg/g，which was identical with predicted value（2.091 mg/g）.

Key words： Castanopcis sclerophylla； flovonoids； response surface methodology； extraction technology

苦櫧（Castanopcis Sclerophylla）別名苦櫧拷、櫧樹、櫧栗，屬殼斗科，是亞熱帶常綠闊葉林的主要群種之一[1]。它主要分布于江西、廣東、福建、四川、云南、湖南、湖北、浙江、安徽、江蘇等地，各地產量較大。苦櫧果實的藥用價值很高，據李時珍《本草綱目》介紹，櫧果實主治陽痿、水腫，有益氣、充饑、明目、壯筋骨、助陽氣、補虛勞、健腰膝、蓋顏色等效用[2]。研究顯示，苦櫧果實中主要含有淀粉、還原糖、果膠、維生素C和黃酮等成分[3]。

黃酮是一類廣泛存在于植物內的多酚類物質，在植物的花、葉、果等組織中，一般以黃酮苷的形式存在[4]。黃酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑[5]。黃酮類化合物對治療冠心病、心絞病、高血壓、支氣管哮喘等有顯著效果，具有抗腫瘤、抗氧化、抗過敏、降血壓、抗炎抗菌、保護心血管等多種作用[6-9]。

響應面分析法（Response Surface Methodology，RSM）是在合理的試驗設計條件下，通過利用多元二次回歸方程擬合多因素與響應值之間的函數關系及分析回歸方程來求得最佳工藝參數，以解決含有多個變量問題的一種數學統計方法。它與被廣泛使用的正交試驗設計法不同，具有試驗周期短，回歸方程精確度高，能研究多因素間交互作用等優點[10]。

目前，對于苦櫧果實的加工利用僅集中于用苦櫧淀粉生產附加值較低的產品，如苦櫧豆腐、粉條、涼皮、苦櫧干粉等產品，而苦櫧果實中黃酮的提取及其提取條件優化工藝少有文獻報道[2，3]。本研究以乙醇作為溶劑，采用回流法通過單因素試驗和Box-Behnken的中心組合試驗，并利用Design-Expert軟件進行響應面優化分析，確定苦櫧果實黃酮的最佳提取工藝參數，為苦櫧果實黃酮的進一步開發利用提供技術支持，期待能為苦櫧果實開發成功能食品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦櫧果實，購自江西撫州東鄉馬圩周家，烘干研磨，過100目篩，置陰涼干燥處備用；蘆丁標準溶液，光譜純，國藥集團化學試劑公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁均為分析純級，均購于湛江康佰生物試劑公司。

1.2 儀器與設備

BS124S型電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；HH-601型超級恒溫水浴鍋，江蘇金壇市億通電子有限公司；UV-7504型單光束紫外-可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司；DG30/14-IIA HG202-IA型電熱干燥箱，南京實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 苦櫧果實黃酮提取工藝 稱量苦櫧果實粉末→倒入浸提回流裝置→加入乙醇溶液浸泡→提取→抽濾→吸取苦櫧黃酮提取液→NaNO2—Al（NO3）3比色法[11]測定黃酮含量。

1.3.2 標準曲線的繪制 精密稱取充分干燥后的蘆丁標準樣品0.055 1 g，置于100 mL容量瓶中，用30%乙醇溶解并定容，搖勻得濃度為0.551 g/L標準溶液[12]。準確吸取蘆丁標準溶液0、1、2、3、4、5 mL于6只25 mL比色管中，0 mL的比色管作為空白對照組，按上述加入試劑的步驟進行，于最大吸收波長λmax處比色測定。以蘆丁質量濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 最大吸收波長的確定 準確吸取蘆丁標準溶液10 mL于25 mL比色管中，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置5 min；加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置5 min；加入4% NaOH溶液2.0 mL，再加入30%乙醇溶液至刻度線，搖勻，放置15 min；同時以蒸餾水替代標準溶液做空白對照。以空白試劑為參比，在495～515 nm范圍內測定蘆丁標準顯色液的吸光度[13]，繪制波長—吸光度曲線以確定蘆丁標準顯色液的最大吸收波長λmax。

1.3.4 總黃酮濃度的測定 取10 mL苦櫧黃酮提取液于25 mL比色管中，同樣按上述步驟加入試劑；同時以提取液[不加入NaNO2、Al（NO3）3和NaOH溶液，只加入30%乙醇溶液至刻度線]作為空白試劑[14]。將做好的顯色試劑搖勻裝入比色皿內（本試驗所用的兩個比色皿吸光度分別為0.041與0.044，以空氣作為空白測得），于最大吸收波長λmax處比色測定，最后根據標準曲線計算黃酮濃度C（μg/mL）。

黃酮提取量=■

式中，V1為每次加入乙醇溶液的體積；V2為第二次定容時比色管的體積，此處為25 mL；V3為抽取濾液的體積，此處為10 mL；m為稱量的苦櫧粉的質量，此處為2.000 g。

1.3.5 單因素試驗設計 以乙醇體積分數、料液比、提取溫度和提取時間4個因素進行單因素試驗，重復3次，確定影響苦櫧果實黃酮提取量的適宜單因素條件。

1）乙醇體積分數的確定。精確稱取苦櫧果實粉末2.000 g 7份，按料液比1∶30（g∶mL，下同），在70 ℃提取溫度下分別用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液回流提取2 h，抽濾，取濾液測定苦櫧果實中黃酮濃度，比較不同乙醇體積分數對苦櫧果實黃酮提取量的影響，由此確定較為優化的乙醇體積分數。

2）料液比的確定。精確稱取苦櫧果實粉末2.000 g 7份，在70 ℃提取溫度下，分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，用50%的乙醇溶液回流提取2 h，抽濾，取濾液測定苦櫧果實中黃酮濃度，比較不同料液比對苦櫧果實黃酮提取量的影響，由此確定較為優化的料液比。

3）提取溫度的確定。精確稱取苦櫧果實粉末2.000 g 7份，用50%的乙醇溶液按料液比1∶30分別在30、40、50、60、70、80、90 ℃提取溫度下回流提取2 h，抽濾，取濾液測定苦櫧果實中黃酮濃度，比較不同提取溫度對苦櫧果實黃酮提取量的影響，由此確定較為優化的提取溫度。

4）提取時間的確定。精確稱取苦櫧果實粉末2.000 g 6份，在提取溫度70 ℃條件下，用50%乙醇溶液按料液比1∶30分別提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，抽濾，取濾液測定苦櫧果實中黃酮濃度，比較不同提取時間對苦櫧果實黃酮提取量的影響，由此確定較為優化的提取時間。

1.3.6 響應面優化試驗 采用Design-Expert 8.0.5.0軟件處理數據。根據單因素試驗結果，利用Box-Behnken設計法，選取乙醇體積分數、料液比、提取溫度、提取時間4個因素作試驗因素，以黃酮提取量為響應值，設計4因素3水平試驗。試驗因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

如圖1所示，在一定范圍內，蘆丁標準溶液的濃度與顯色液的吸光度之間呈良好的線性關系，滿足方程y=98.776x-0.907 4，R2=0.998 8。

2.2 蘆丁標準顯色溶液最大吸收波長的測定

如圖2所示，蘆丁標準溶液經顯色后，在波長495～515 nm區間內，最大吸收波長為510 nm。因此，通過比色法測定苦櫧果實黃酮的含量時，其波長也選定為510 nm。

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 乙醇體積分數 如圖3所示，不同體積分數的乙醇對苦櫧黃酮提取量有明顯影響。在30%～50%的范圍內，隨著乙醇體積分數的增加，苦櫧果實黃酮提取量增加；當乙醇體積分數為50%時，黃酮提取量最大；在50%～90%的范圍內，黃酮提取量隨著體積分數的升高而下降。因此，乙醇為50%時提取效果最佳。不同的有效成分在不同的溶劑內溶解性有很大的區別，使用不同的溶劑提取相同的材料，可得到不同的提取液[15]。溶劑濃度不同，產生的滲透壓大小也不同，進而影響提取量[16]。本研究的結果表明，隨著乙醇體積分數的增加，苦櫧果實黃酮提取量先增后減，且變化幅度很大。這主要是由于乙醇體積分數較低時，黃酮溶解度較差，水的含量相對較高，以水作為提取劑，把蛋白質、糖類等易溶于水的物質提取出來，因而當乙醇體積分數較低時，黃酮提取量較低；而乙醇體積分數過高時會產生較大的滲透壓，一些脂溶性物質的溶出量增大，使黃酮類物質的溶解度降低，從而導致黃酮提取量降低。

2.3.2 料液比 如圖4所示，1∶10～1∶35的料液比范圍內，黃酮提取量隨著溶劑的增大而增大；當料液比為1∶35時，黃酮提取量最大；當料液比小于1∶35時，苦櫧果實的黃酮提取量降低。所以，提取效果最佳的料液比為1∶35。

料液比能影響固液兩相中有效成分的濃度梯度，進而影響提取速率[15]。固液兩相中，提取液有效成分擴散是否達到平衡對提取量存在影響[16，17]。由本研究結果可以看出，隨著料液比的增加，苦櫧果實黃酮提取量先增后減，變化幅度較大。這可能是因為料液比的增加降低了提取溶液中黃酮的濃度，從而增加固液兩相中黃酮的濃度梯度，進而提高黃酮溶出的速度，最終提高提取量。當擴散達到平衡時，增加提取劑的比值并不會促進黃酮的提取，溶劑用量的增加反而會導致其他雜質過多溶出，從而降低黃酮的提取量。

2.3.3 提取溫度 如圖5所示，在30～80 ℃的溫度范圍內，苦櫧果實黃酮提取量隨著溫度的升高而增加；當提取溫度為80 ℃時，黃酮提取量最大；超過80 ℃后，隨溫度的升高，提取量降低。因此，提取溫度為80 ℃時提取效果最佳。

在提取過程中，溫度升高可促進分子運動，軟化組織，增加溶解性、滲透性，降低溶液黏度，從而提高提取效率[18]。溫度過高會破壞易熱解物質的結構[19]。本研究結果表明，隨著提取溫度的增加，苦櫧果實黃酮提取量先增后減，變化幅度較大。這主要是由于溫度的升高能增加黃酮的運動程度，也可使苦櫧果實組織的細胞壁容易破裂，從而加速黃酮的滲透、擴散、溶解速度等，使之更容易被提取出來；但過高的溫度容易引起黃酮被氧化破壞，從而導致黃酮提取量降低。

2.3.4 提取時間 如圖6所示，苦櫧果實黃酮的提取量在2.5 h之前隨著提取時間的延長而增加，2.5 h時，黃酮提取量最大；2.5 h后隨著時間的增長提取量反而降低。所以，最佳的提取時間為2.5 h。

提取時間越長，所能提取出的有效成分就越多，但過長的提取時間也常常會提取出一些無效成分，影響提取效果[18]。由本研究結果可以看出，隨著時間的延長，黃酮提取量也是先增后減，但變化幅度較小。這主要是因為提取時間過短時，黃酮不能充分溶出，適當的延長提取時間則有利于黃酮充分的擴散浸出；而提取時間過長，大量的水溶性物質溶出，提取液變黏稠而對黃酮產生吸附作用，導致黃酮不能快速擴散析出，亦可能使黃酮結構被破壞，從而降低黃酮的提取量。

2.4 響應面分析與優化

2.4.1 回歸模型的建立 對響應面試驗共設計29個試驗點，設計及結果見表2。采用響應面分析法分析試驗結果，得到以黃酮提取量為響應值的回歸方程：黃酮提取量=-24.790 85+0.410 89A+0.334 68B+0.185 11C+2.168 83D+0.001 375AB-0.000 187 5AC-0.003 7AD + 0.000 28BC + 0.0027BD + 0.00005CD -0.004 292 67A2 - 0.006 040 67B2 - 0.001 115 17C2 -0.413 07D2各因素的方差分析見表3。由表3可知，模型P<0.000 1，表明該二次方程模型極顯著，失擬項P=0.533 5，不顯著，表明該方程對試驗結果擬合情況好、誤差小，因此可用該回歸方程對試驗結果進行分析和預測。

2.4.2 響應面交互作用分析與優化 用Design-Expert軟件對表2數據進行四元二次回歸擬合，所得回歸方程的響應面等高線曲面圖（圖7～圖12）。由圖7（a）可知，乙醇體積分數的曲面較陡，料液比的平面比較平緩，說明乙醇體積分數對苦櫧果實黃酮提取量的影響較顯著，而料液比的影響不顯著；圖7（b）中等高線沿乙醇體積分數軸向較料液比軸向密集，說明乙醇體積分數對苦櫧果實黃酮提取量的影響比料液比大；等高線為橢圓形，說明乙醇體積分數與料液比的交互作用較強，對苦櫧果實黃酮提取量的影響顯著。

由圖8（a）可知，乙醇體積分數的曲面較陡，提取溫度的平面比較平緩，說明乙醇體積分數對苦櫧果實黃酮提取量的影響較顯著，而提取溫度的影響不顯著；圖8（b）中等高線沿乙醇體積分數軸向較提取溫度軸向密集，說明乙醇體積分數對苦櫧果實黃酮提取量的影響比提取溫度大；等高線為橢圓形，說明乙醇體積分數與提取溫度的交互作用較強，對苦櫧果實黃酮提取量的影響顯著。

由圖9（a）可知，乙醇體積分數的曲面較陡，提取時間的平面比較平緩，說明乙醇體積分數對苦櫧果實黃酮提取量的影響較顯著，而提取時間的影響不顯著；圖9（b）中等高線沿乙醇體積分數軸向較提取時間軸向密集，說明乙醇體積分數對苦櫧果實黃酮提取量的影響比提取時間大；等高線為橢圓形，說明乙醇體積分數與提取時間的交互作用較強，對苦櫧果實黃酮提取量的影響顯著。

由圖10（a）可知，提取溫度的曲面較陡，料液比的平面比較平緩，說明提取溫度對苦櫧果實黃酮提取量的影響較顯著，而提取溫度的影響不顯著；圖10（b）中等高線為橢圓形，說明料液比與提取溫度的交互作用較強，對苦櫧果實黃酮提取量的影響顯著。

由圖11（a）所示，料液比的曲面較陡，提取時間的平面比較平緩，說明料液比對苦櫧果實黃酮提取量的影響較顯著，而提取時間的影響不顯著；圖11（b）中等高線沿料液比軸向較提取時間軸向密集，說明料液比對苦櫧果實黃酮提取量的影響比提取時間大；等高線比較接近圓形，說明料液比與提取時間的交互作用較弱，對苦櫧果實黃酮提取量的影響不顯著。

由圖12（a）可知，提取溫度的曲面較陡，提取時間的平面比較平緩，說明提取溫度對苦櫧果實黃酮提取量的影響較顯著，而提取時間的影響不顯著；圖12（b）中等高線為橢圓形，說明料液比與提取時間的交互作用較強，對苦櫧果實黃酮提取量的影響顯著。

由各響應面立體圖可看出，響應值存在最大值。通過軟件分析計算得出，苦櫧果實黃酮的最佳提取工藝為乙醇體積分數50.72%，料液比1∶35.97，提取時間2.52 h，提取溫度83.30 ℃。考慮到實際操作的便利，調整其最佳提取工藝條件為乙醇體積分數50%，料液比1∶36，提取時間2.5 h，提取溫度83 ℃。在此條件下，重復試驗3次，苦櫧果實黃酮提取量平均實測值為2.107 mg/g，與預測值（2.091 mg/g）相差0.016 mg/g，說明該方程與實際情況的擬合性良好，充分證明了該回歸方程的可靠性。

3 結論

以乙醇溶液作為溶劑，采用回流法提取苦櫧果實黃酮，在單因素試驗結果的基礎上，采用Design-Expert軟件的Box-Behnken設計法設計響應面試驗，建立了苦櫧果實黃酮的四元二次回歸方程，經檢驗該回歸方程是合理可靠的，能較好地預測苦櫧果實黃酮的提取量，優化了苦櫧果實黃酮的最佳提取工藝條件。結果表明，乙醇體積分數、料液比和提取溫度對苦櫧果實黃酮的提取效果影響較大，而提取時間影響較小。結合響應面交互作用分析結果和實際情況預測最佳條件，并驗證后得出苦櫧果實黃酮的最佳提取條件為乙醇體積分數50%，料液比1∶36，提取時間2.5 h，提取溫度83 ℃。此條件下黃酮的提取量為2.107 mg/g，與預測值（2.091 mg/g）基本相符，充分證明了該模型的可靠性。

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