Hg²⁺、Pb²⁺對牛蛙坐骨神經干動作電位閾值及傳導速度的影響

摘要：為了觀察重金屬離子（Hg2+和Pb2+）對牛蛙離體坐骨神經干動作電位傳導速度的影響，探討重金屬離子Hg2+和Pb2+污染對兩棲類動物牛蛙的作用，制備牛蛙離體坐骨神經干，分為Hg2+浸泡液濃度組（0.02、0.04、0.08、0.10、0.20、0.30 mg/L）；Pb2+浸泡液濃度組（0.08、0.15、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/L）；Hg2+和Pb2+混合浸泡液濃度組（Hg2+ 0.064 mg/L+Pb2+ 0.080 mg/L，Hg2+ 0.048 mg/L+Pb2+ 0.160 mg/L，Hg2+ 0.032 mg/L+Pb2+ 0.240 mg/L，Hg2+ 0.016 mg/L+Pb2+ 0.320 mg/L），用BL-420F生物機能實驗系統引導神經干動作電位，測定神經干動作電位閾值及傳導速度。結果表明，Hg2+不同處理主要起增大牛蛙坐骨神經干閾值作用，Pb2+不同處理下牛蛙坐骨神經干閾值變化不明顯，Hg2+與Pb2+聯合則牛蛙坐骨神經干閾值大多表現增大且Hg2+起主要作用。Hg2+、Pb2+以及Hg2+與Pb2+聯合時牛蛙離體坐骨神經干動作電位傳導速度均出現不規律變化。

關鍵詞：重金屬離子；Hg2+；Pb2+；動作電位；閾值；傳導速度

中圖分類號：Q958.8 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5316-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.037

Abstract： This study was aimed at observing the effect of heavy metal ions （Hg2+ and Pb2+） on the action potential and conduction velocity of bullfrog sciatic nerve， and researching the effect of Hg2+ and Pb2+ ions pollution on amphibians bullfrog. The prepared bullfrog sciatic nerve trunk were divided into Hg2+ groups which soaked in the liquid of concentration 0.02 mg/L，0.04 mg/L，0.08 mg/L，0.10 mg/L，0.20 mg/L，and 0.30 mg/L；the Pb2+ groups were soaked in the liquid of concentration 0.08 mg/L，0.15 mg/L，0.2 mg/L，0.40 mg/L，0.80 mg/L and 1.00 mg/L. The mixed Hg2+ and Pb2+ groups were soaked in liquid of concentration Hg2+ 0.064 mg/L+Pb2+ 0.080 mg/L，Hg2+ 0.048 mg/L+Pb2+ 0.160 mg/L， Hg2+ 0.032 mg/L+Pb2+ 0.240 mg/L and Hg2+ 0.016 mg/L+Pb2+ 0.320 mg/L. The action potential of sciatic nerve trunk was induced and detected by BL-420 system of biological function experiment. The results showed that Hg2+ presented increasing effect on the action potential threshold，while Pb2+ showed no significant effect on the action potential threshold. The joined effect of Hg2+ and Pb2+ showed increasing effect on the threshold and Hg2+ played a main role. The conduction velocity all showed irregular change whatever treated with Hg2+， Pb2+ or mixed Hg2+ and Pb2+.

Key words： heavy metal ions；Hg2+；Pb2+；action potential；threshold； conduction velocity

兩棲動物是最原始的陸生脊椎動物，既有適應陸地生活的新的性狀，又有從魚類祖先繼承下來的適應水生生活的性狀。同時兩犧動物是農林生態系統的重要組成部分，在控制害蟲和無公害農業的發展中起著重要的作用。它們的防御、擴散、遷移的能力較弱，對環境的依賴性大。近年來，大量工農業以及生活污染物的排放使生態環境受到了嚴重污染和破壞，給兩棲類動物的生存帶來了不利影響[1]。重金屬元素若進入體內量過大，沉積到器官或細胞內，會使得兩棲類動物在行為表現、生長發育、生理生化、形態組織等各方面發生顯著變化，甚至可能導致死亡[1]。國內外許多學者研究報道了重金屬離子對蛙類以及對兩棲類的毒性，但有關Hg2+和Pb2+對牛蛙坐骨神經干電生理特性的影響尚未見報道。本試驗測定了在Hg2+和Pb2+的脅迫下牛蛙的坐骨神經神經干電位的產生和傳導特性，其目的在于了解Hg2+和Pb2+對牛蛙坐骨神經性能的影響，并為保護兩犧類動物和維持生態平衡提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗用牛蛙于2013年3月采自河南省信陽市，選取體重基本一致、活性良好的牛蛙成體（雌雄不拘）置于培養箱內靜養，24 h后用于試驗[2]。

1.2 試驗儀器

生物信號采集處理系統（BL-420F外置式，成都泰盟軟件有限公司），神經屏蔽盒（成都泰盟軟件有限公司）引導電極，刺激電極，聯想臺式計算機，常規解剖器械（解剖針、玻璃針、骨剪、鑷子），燒杯，蛙板，膠頭滴管，棉簽，移液槍及槍頭，小木塊，手套，離心管或培養皿。

試驗參數設置：（1）尋找閾值：單刺激（延時 5 ms，波寬0.05 ms，細電壓，刺激電壓0 V，增量0.05 V，主周期4 s，手動停止）。（2）測量牛蛙坐骨神經干動作電位傳導速度：單刺激（延時5 ms，波寬0.05 ms，細電壓，刺激電壓1 V，增量0 V，主周期10 s，停止次數8）。

1.3 藥品與試劑

標準任氏液配制：分析天平稱取NaCl（天津市大茂化學試劑廠）32.5 g、KCl（信陽市化學試劑廠）1.4 g、CaCl2（天津市凱通化學試劑有限公司）1.2 g、NaHCO3（天津市大茂化學試劑廠）4 g、NaH2PO4（國藥集團化學試劑有限公司）1 g、葡萄糖（天津市博迪化工有限公司）2 g，加蒸餾水至1 000 mL。

Hg2+和Pb2+溶液以任氏液為溶劑配制[HgCl2分析純，相對分子質量272，Pb（CH3COO）2分析純，相對分子質量325]。

1.4 試驗方法

1.4.1 牛蛙離體坐骨神經干的制備 用常規方法制備牛蛙坐骨神經干標本。首先用天平稱量牛蛙，然后左手食指按壓其頭部前端，右手自兩眼間的中線向后劃，觸到凹陷的枕骨大孔，用解剖針先垂直向下再向前插入并攪動破壞腦髓，在稍微退出向后插入并攪拌破壞脊髓，直至蛙后肢及肌肉完全松弛。將蛙放在蛙板上，牽拉蛙的肚皮剪開然后在腹壁肌肉剪開翻開。從下往上數沿第三節脊柱兩側剪除一切內臟和頭、胸部，保留后肢、骶脊柱及脊柱兩側的坐骨神經。然后用玻璃針、手術剪小心剝離坐骨神經。剪去坐骨神經上脊柱骨帶的肉，并用棉簽擦去神經上附帶的血管、黏膜。

制備過程避免牽拉和用金屬器械碰觸到神經干以防損傷神經干。待標本制好后放入標準任氏液中平衡10 min[3]備用。

1.4.2 神經干動作電位的引導 首先將所有經標準任氏液浸泡過的坐骨神經干標本置于神經屏蔽盒的電極上，在1、5、10、15、20、25 min[4，5]時分別刺激神經中樞端由外周端導出動作電位波形，測出兩引導點之間的距離（S）（測定閾值，計算動物電位傳導速度，作為對照）。然后再將標本分為3組，分別置于Hg2+浸泡液[6]（0.02、0.04、0.08、0.10、0.20、0.30 mg/L）、Pb2+浸泡液（0.08、0.15、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/L）[7]以及Hg2+和Pb2+混合浸泡液（Hg2+ 0.064 mg/L+Pb2+ 0.080 mg/L，Hg2+ 0.048 mg/L+Pb2+ 0.160 mg/L，Hg2+ 0.032 mg/L+Pb2+ 0.240 mg/L，Hg2+ 0.016 mg/L+Pb2+ 0.320 mg/L）浸泡10 min后待1、5、10、15、20、25 min時刺激神經干，分別導出動作電位波形，測出兩引導點之間的距離（S），記錄數據。觀察牛蛙坐骨神經干經不同濃度Hg2+、Pb2+、Hg2+和Pb2+混合溶液處理后在不同時間點對其動作電位閾值和傳導速度的影響。

1.5 數據處理

測量神經干接受刺激到沖動產生所需的時間（t）和兩引導點之間的距離（S），計算動作電位傳導速度（m/s）（計算公式：動作電位傳導速度=S/t），數據均以平均值±標準差表示[8]。

2 結果與分析

2.1 不同濃度Hg2+處理牛蛙坐骨神經干動作電位閾值和傳導速度

2.1.1 不同濃度Hg2+處理后牛蛙坐骨神經干動作電位閾值 由表1可見，當Hg2+濃度為0.04和0.10 mg/L時牛蛙坐骨神經干動作電位的閾值較對照減小，其他濃度處理后其閾值較對照均增加。

2.1.2 不同濃度Hg2+處理對牛蛙坐骨神經干動作電位傳導速度的影響 由表2可見，不同濃度Hg2+溶液對牛蛙坐骨神經干動作電位傳導速度有影響。在同一時間點，不同濃度Hg2+溶液處理與任氏液對照組比較均差異明顯。同一濃度下，隨著處理時間的延長，牛蛙坐骨神經干動作電位傳導速度呈現不規律的變化。在5、10、15 min時均以0.20 mg/L的Hg2+溶液處理的傳導速度最低。不同濃度的Hg2+處理后絕大多數在5 min時傳導速度達到最低值。

2.2 不同濃度Pb2+處理后牛蛙坐骨神經干動作電位閾值和傳導速度

2.2.1 不同濃度Pb2+處理對牛蛙坐骨神經干動作電位閾值的影響 由表3可見，不同濃度的Pb2+處理后牛蛙坐骨神經干動物電位閾值變化不明顯，Pb2+0.08 mg/L處理后牛蛙坐骨神經干動物電位閾值增大；Pb2+ 0.15、0.40和1.00 mg/L處理后牛蛙坐骨神經干動物電位閾值無變化；Pb2+ 0.20和0.80 mg/L處理后牛蛙坐骨神經干動物電位閾值減小。

2.2.2 不同濃度Pb2+處理對牛蛙坐骨神經干動作電位傳導速度的影響 由表4可見，各組相比較，1、5 min時均以Pb2+ 0.80 mg/L處理時牛蛙坐骨神經干動作電位傳導速度最低；10 min時以任氏液對照組牛蛙坐骨神經干動作電位傳導速度最低；15 min時以Pb2+ 1.00 mg/L處理時牛蛙坐骨神經干動作電位傳導速度最低；20 min時Pb2+ 0.40 mg/L處理時牛蛙坐骨神經干動作電位傳導速度最低；25 min時以Pb2+ 0.15 mg/L處理時牛蛙坐骨神經干動作電位傳導速度最低。

2.3 不同濃度Hg2+和Pb2+聯合處理后牛蛙坐骨神經干動作電位閾值和傳導速度

2.3.1 不同濃度Hg2+和Pb2+聯合處理對牛蛙坐骨神經干動作電位閾值的影響 根據前面Hg2+和Pb2+的單獨試驗可知在Hg2+ 0.08 mg/L和Pb2+ 0.40 mg/L時試驗數據較為穩定。因此在Hg2+和Pb2+聯合試驗就采用Hg2+ 0.08 mg/L和Pb2+ 0.40 mg/L為母液分別配比出Hg2+∶Pb2+=8∶2，Hg2+∶Pb2+=6∶4，Hg2+∶Pb2+=4∶6，Hg2+∶Pb2+=2∶8即（Hg2+ 0.064 mg/L+Pb2+ 0.08 mg/L，Hg2+ 0.048 mg/L+Pb2+ 0.160 mg/L，Hg2+ 0.032 mg/L+Pb2+ 0.240 mg/L，Hg2+ 0.016 mg/L+Pb2+ 0.320 mg/L四個濃度梯度。

由表5可見，Hg2+和Pb2+聯合處理后牛蛙坐骨神經干動物電位閾值大多數表現增大（Hg2+∶Pb2+=2∶8時牛蛙坐骨神經干動物電位閾值減小），這表明Pb2+所占比例越大牛蛙坐骨神經干動物電位閾值就減小，在Hg2+和Pb2+混合處理時主要起降低神經的靈敏度并減小閾值的作用。

2.3.2 不同濃度Hg2+和Pb2+聯合處理對牛蛙坐骨神經干動作電位傳導速度的影響 由表6可見，在同一時間點，不同濃度Hg2+與Pb2+混合溶液處理后牛蛙坐骨神經干動作電位傳導速度與任氏液對照組相比差異明顯。Hg2+與Pb2+混合溶液處理同一濃度下，隨著處理時間的延長，牛蛙神經干動作電位傳導速度呈不規律的變化。

3 小結與討論

本試驗應用電生理方法觀察了重金屬離子（Hg2+和Pb2+）對牛蛙離體坐骨神經干動作電位閾值和傳導速度的影響。結果表明，Hg2+處理后牛蛙坐骨神經干動作電位閾值普遍增大，Pb2+處理后牛蛙坐骨神經干動作電位閾值的變化不明顯。Hg2+和Pb2+聯合處理后牛蛙坐骨神經干動作電位閾值普遍增大。隨著Hg2+在聯合溶液中所占比重的增大，閾值增大的趨勢也越明顯，說明Hg2+和Pb2+聯合溶液中Hg2+起主要增大牛蛙坐骨神經干動作電位閾值的作用。

從Hg2+溶液處理后牛蛙坐骨神經干動作電位傳導速度可知，不同濃度的Hg2+溶液處理后大多在5 min時動物電位傳導速度達到最低。比較同一時間點，在5、10、15 min時均以0.2 mg/L Hg2+處理的牛蛙坐骨神經干動作電位傳導速度最低。Pb2+溶液處理后，0.08及0.40 mg/L Pb2+處理均在20 min時動作電位傳導速度達到最低。Hg2+和Pb2+聯合處理下，5、20 min時Hg2+∶Pb2+=6∶4時牛蛙坐骨神經干動物電位傳導速度最低；10、15、25 min時Hg2+∶Pb2+=8∶2時牛蛙坐骨神經干動物電位傳導速度最低。比較聯合處理同一比例下，Hg2+∶Pb2+=8∶2及Hg2+∶Pb2+=4∶6時均在25 min時動作電位傳導速度最低；Hg2+∶Pb2+=6∶4時在5 min時動作電位傳導速度最低；Hg2+∶Pb2+=2∶8時在1 min時動作電位傳導速度最低。

目前對重金屬的毒性作用已有眾多的研究，但是關于Hg2+和Pb2+以及兩者共同作用對牛蛙坐骨神經干動作電位的影響機制尚未見相關研究。Hg2+和Pb2+都能改變細胞酶的催化活性[9]，這可能是其影響牛蛙坐骨神經干動作電位閾值傳導速度的主要原因。

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