茯苓菌絲體生物量、多糖含量的測定

摘要：通過收集經液體培養(yǎng)的茯苓1號[Poria cocos（Schw.）Wolf. Strain 1]、茯苓5.78號（P. cocos Strain 5.78）菌株菌絲體，并干燥后稱重，比較其生物量產率；采用苯酚-硫酸法，分別測定茯苓1號、茯苓5.78號菌株菌絲體的多糖吸光度，從而測定出其多糖含量。結果表明，茯苓1號比茯苓5.78號生長速度快，生物量大；茯苓5.78號菌絲體的多糖含量比茯苓1號高。說明在相同的液體培養(yǎng)基條件下，茯苓1號、茯苓5.78號菌株的菌絲體生長速度不同；茯苓多糖含量也不一樣。

關鍵詞：茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf.]；液體培養(yǎng)；生物量；多糖

中圖分類號：S567.3+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5279-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.028

Abstract： Mycelia were collected by liquid culture of Poria cocos（Schw.） Wolf. Strain 1 and P. cocos Strain 5.78， dryed and weighed so as to compare their biomass. The colorimetric method of phenol and sulfuric acid was applied for measuring the polysaccharide absorbance of P. cocos Strain 1 and P. cocos Strain 5.78 to test the content of polysaccharide. The P. cocos Strain 1 grew fasterthan P. cocos Strain 5.78 and had large biomass. But P. cocos Strain 5.78 had higher polysaccharide content. Under the same liquid cultivation conditions， the mycelia of P. cocos Strain 1 and P. cocos Strain 5.78 had different growth rate as well as different content of polysaccharide.

Key words： Poria cocos（Schw.） Wolf.； liquid culture； biomass； polysaccharide

中藥茯苓是多孔菌科（Polyporaceae）茯苓屬（Wolfiporia Ryv.et Gilbn）茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf.]的干燥菌核炮制而成，具有滲濕利尿、健脾寧心等功效。茯苓的化學成分主要有茯苓多糖、三萜、樹膠、甾醇、蛋白質、維生素、微量元素等[1]。近年來，國內外眾多學者對茯苓多糖進行了大量分析研究，發(fā)現(xiàn)其具有增強免疫能力、延緩衰老、抗病毒、抗腫瘤、降血糖等藥理功效[2]，可廣泛應用于食品、醫(yī)療保健等領域，因此市場需求量不斷攀升。然而人工種植茯苓存在許多技術處理難題，容易受氣候和地域等條件限制，同時存在產量不高、生產周期長、病蟲害控制帶來的殘留等問題，并且要消耗大量木材，因而飽受詬病。用液體培養(yǎng)技術生產茯苓菌絲體、從茯苓菌絲體和發(fā)酵液中提取茯苓多糖等活性物質，可以很好地解決人工種植茯苓的替代問題，還能節(jié)省大量木材，這對于森林資源和生物多樣性的保護有著重要的意義。液體培養(yǎng)生產茯苓菌絲體可連續(xù)性地進行規(guī)模化工業(yè)生產，能大大縮短生產周期，降低生產成本[3]。這對于茯苓多糖的測定、提取及開發(fā)意義重大，所以試驗選擇性地對茯苓1號、茯苓5.78號菌株菌絲體實施了生物量、多糖含量的測定，以期能進一步為茯苓藥用品及保健品開發(fā)等提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茯苓菌株 供試茯苓菌株為茯苓1號和茯苓5.78號，均引自安徽省岳西多生食用菌專業(yè)合作社。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①斜面、平板培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、水1 000 mL、pH自然。②種子培養(yǎng)基[3]：葡萄糖20 g、蛋白胨4 g、酵母浸膏5 g、K2HPO4 1 g、KH2PO4 0.46 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、水1 000 mL。③發(fā)酵培養(yǎng)基[4]：葡萄糖30 g、蛋白胨4 g、酵母浸膏5.1 g、K2HPO4 1 g、KH2PO4 0.46 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、水1 000 mL，pH 5.5。

1.1.3 試劑與儀器 主要有石油醚、80%乙醇、5%苯酚、1 mol/L 氫氧化鈉、葡萄糖等。儀器主要有無菌接種臺、恒溫培養(yǎng)箱、實驗用冰箱、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)用搖床、電子控溫烘箱、紫外分光光度計、索氏提取器、布氏漏斗和抽濾瓶等。

1.2 試驗方法

1.2.1 PDA培養(yǎng)基接種前檢驗 將斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基一起放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，如無菌生長，方可使用。

1.2.2 母種的擴接 將茯苓1號、茯苓5.78號母種試管中的菌絲體連帶著培養(yǎng)基轉接入不同斜面培養(yǎng)基的中央，接種好后，塞上膠塞，貼上寫有接種時間、菌絲體種類的標貼，于恒溫培養(yǎng)箱中26 ℃恒溫培養(yǎng)。約一個星期后，接種的茯苓1號、茯苓5.78號菌絲體長滿試管，即可進行平板培養(yǎng)基的接種或放入4 ℃冰箱中保存。

1.2.3 平板培養(yǎng)基的接種 先后從茯苓1號、茯苓5.78號斜面菌種中用接種鉤分別挑起1塊約1 cm×1 cm菌塊，接入裝有平板培養(yǎng)基的不同培養(yǎng)皿的中央，每個菌種接5個平板，用封口膜封口，于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d，待菌絲長滿培養(yǎng)皿。

1.2.4 種子培養(yǎng)基的接種及培養(yǎng) 按種子培養(yǎng)基配方配制500 mL種子培養(yǎng)基，配好后，分裝入10個250 mL三角瓶中，每個三角瓶50 mL，加塞，于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min左右后取出，冷卻至室溫待用。再分別用2個打孔器把生長于平板培養(yǎng)基外側的茯苓1號、茯苓5.78號菌絲打孔，先后接種到不同的三角瓶種子培養(yǎng)基中，每瓶接種4塊直徑為1 cm的圓形菌塊，貼上寫有接種時間、菌絲體種類的標貼。放于培養(yǎng)溫度為26 ℃、轉速為150 r/min的恒溫搖床中進行搖瓶培養(yǎng)4 d[3，5]。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的接種與搖床培養(yǎng) 先按配方配好發(fā)酵培養(yǎng)基1 000 mL，調節(jié)pH至5.5，分裝入250 mL三角瓶中，每瓶裝液50 mL。于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，滅菌完畢后取出冷卻至室溫。每瓶發(fā)酵培養(yǎng)基以10%的比例接入液體種子菌種，茯苓1號、茯苓5.78號各接種8瓶，貼標貼后放于培養(yǎng)溫度為26 ℃、轉速為150 r/min的恒溫搖床中進行搖瓶培養(yǎng)[6]。

1.3 茯苓生物量測定

1.3.1 茯苓菌絲體生長速度的測定 分別用打孔器打孔接種1塊直徑為1 cm的茯苓1號、茯苓5.78號平板培養(yǎng)基菌種在直徑為95 mm的平板中央，茯苓1號和茯苓5.78號各接3個平板。接種后，用封口膜將平板密封。于26 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h測定菌塊菌絲生長的直徑，直至菌絲長滿平板為止結束測量。根據菌絲體生長直徑大小的不同，比較茯苓 1號、茯苓5.78號菌株菌絲的生長速度[4]。

1.3.2 茯苓菌絲體干重的測定 收取的菌絲體發(fā)酵液用布氏漏斗和抽濾瓶真空抽濾。抽濾過程中，用去離子水反復洗滌菌絲球5～6次，直到洗凈菌絲球中殘留的培養(yǎng)液為止，期間要注意濾液不能加得太滿，以防濾液被抽入真空泵。得到的菌絲球于烘箱中，60 ℃下烘至恒重，稱量，以50 mL發(fā)酵液中菌絲體干重（g/50 mL）作為計量單位。然后以培養(yǎng)時間為橫坐標，菌絲體生物量（干重）為縱坐標，繪制茯苓1號、茯苓5.78號菌絲發(fā)酵過程中菌絲體的生長曲線[3]。

1.4 茯苓多糖含量的測定

1.4.1 對照品溶液的配制 精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖50 mg，置50 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，再用移液管吸取5 mL，置另一個50 mL容量瓶中，加去離子水稀釋至刻度，即得濃度為0.100 mg/mL的葡萄糖標準溶液。

1.4.2 標準曲線的繪制 精密量取葡萄糖標準液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于15 mL試管中，編號為1～7，都加水至1.0 mL，再加入5%苯酚溶液1.2 mL，待充分混勻后，迅速加入濃硫酸7.0 mL；再充分混勻后，置45 ℃水浴中30 min，然后移至冰水浴中30 min。取出后，在紫外分光光度計上于490 nm處測其吸光度值[7]。以標準葡萄糖含量（mg）為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，即得到一條標準曲線（圖1），由此得回歸方程。

1.4.3 樣品茯苓多糖的提取 用索氏提取器提取樣品的茯苓多糖，茯苓多糖采用文獻[7]的苯酚-硫酸比色法測定。用紫外分光光度計，在490 nm處測其吸光度值，根據回歸方程計算茯苓1號、茯苓5.78號菌絲體多糖的百分含量。

2 結果與分析

2.1 茯苓生物量

2.1.1 茯苓菌絲體生長速度的測定和分析 茯苓菌絲體生長速度測定結果見圖2。由圖2可見，將活化的茯苓1號、茯苓5.78號同時采用打孔器接種到平板上培養(yǎng)后，其菌絲體生長速度是茯苓1號比茯苓5.78號快，且生長更旺盛，說明茯苓1號比茯苓5.78號更適應液體發(fā)酵培養(yǎng)。

2.1.2 茯苓菌絲體生物量（干重）的測定和分析 茯苓菌絲體生物量測定結果見圖3。從圖3可見，茯苓菌絲體經液體發(fā)酵培養(yǎng)后，隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，茯苓菌絲體生物量逐漸增加，培養(yǎng)8 d時，茯苓1號菌絲體生物量最大，為0.310 g/50 mL；當生長到12 d時，茯苓1號菌絲球已經開始自溶，生物量轉為下降趨勢。茯苓5.78號的生長則稍微緩慢一點，當培養(yǎng)時間到10 d時，生物量達到最大值，為0.305 g/50 mL；繼續(xù)生長到14 d時，茯苓5.78號菌絲球自溶，生物量轉為下降趨勢。

2.2 茯苓多糖含量

樣品溶液多糖含量的測定結果表明，茯苓1號、茯苓5.78號菌絲體中多糖含量都很高，茯苓1號菌絲體多糖含量達到82.4%，茯苓5.78號菌絲體多糖含量達到86.2%。與李真鹍等[7]報道的發(fā)酵茯苓菌絲體中多糖的含量不低于55%，最高可達87%的結果相差不大。

3 小結與討論

目前，傳統(tǒng)的茯苓栽培法仍是茯苓生產的主要方式，但該方式受氣候和地域等條件限制，存在產量不高、生產周期長等不足。而用液體發(fā)酵培養(yǎng)方法生產茯苓，可不受氣候、地域、病蟲害等條件的制約，生長周期短、產量大，易于實現(xiàn)工業(yè)化生產，具有廣闊的開發(fā)應用前景[8]。茯苓多糖是近年來研究較多的一種真菌多糖，其質量約占整個茯苓菌核干重的70%～90%[9]。由茯苓1號、茯苓5.78號菌絲體多糖含量的比較可推測出，茯苓多糖含量可能與發(fā)酵時間有關，在發(fā)酵終點內，發(fā)酵時間越長，多糖的產量越高。茯苓1號、茯苓5.78號菌絲體多糖含量都超過了80%，具有很好的開發(fā)前景，可以通過液體培養(yǎng)技術大量生產茯苓1號、茯苓5.78號菌絲體，再用菌絲體來提取茯苓多糖，加工成營養(yǎng)保健品或生物藥劑等終端產品，從而造福人類。

目前多數(shù)真菌發(fā)酵主要依據菌絲體的產量、培養(yǎng)液中的pH、還原糖、含氮量、培養(yǎng)液的顏色變化以及菌絲球的形態(tài)變化等因素來判斷[10]，所以在茯苓菌絲體液體發(fā)酵過程中，發(fā)酵終點的判斷還需深入研究；另外本試驗的茯苓菌絲體產量低于文獻報道，需進一步作培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交設計或響應面試驗來探究。

參考文獻：

[1] 王 帥，姜艷艷，朱乃亮，等.茯苓化學成分分離與結構鑒定[J].北京中醫(yī)藥大學學報，2010，33（12）：841-844.

[2] 林 燕，黃嘉鵬.茯苓有效成分的藥理作用研究進展[J].中外健康文摘，2010，7（9）：271-272.

[3] 李 羿，萬德光，裴 瑾，等.茯苓液體發(fā)酵條件的研究[J].成都中醫(yī)藥大學學報，2005，28（1）：52-55.

[4] 胡國元，游慧珍，董蘭蘭，等.茯苓菌絲體液體培養(yǎng)條件研究[J].武漢工程大學學報，2010，7（7）：1-4.

[5] 胡國元，李偉偉.富硒金針菇深層培養(yǎng)研究[J].湖北民族學院學報，2002，18（2）：21-23.

[6] 王偉霞，李福后，陳立國.茯苓菌絲體液體培養(yǎng)條件研究[J].食用菌，2006（2）：6-8.

[7] 李真鹍，段 啟，李改云.茯苓多糖含量測定方法研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2011，26（5）：26-27.

[8] 李 羿，李 晨，游元元，等.茯苓發(fā)酵罐補料液體發(fā)酵的研究[J].化學研究與應用，2011，23（7）：847-851.

[9] 張 敏，高曉紅，孫曉萌，等.茯苓的藥理作用及研究進展[J].北華大學學報（自然科學版），2008，9（1）：63-68.

[10] 陶文沂，敖宗華，許泓瑜，等.藥食用真菌生物技術[M].北京：化學工業(yè)出版社，2007.59-60.