牦牛和雄性不育犏牛睪丸中Prm1和Prm2基因表達

摘要：為探索牦牛（Bos grunniens）雜交后代（犏牛）雄性不育的分子機制，比較了牦牛及其雜交后代睪丸中兩種精蛋白（Prm）基因的表達。從成年牦牛（n=13）和犏牛（n=7）睪丸中提取總RNA，定量PCR分析表明，犏牛睪丸中Prm1和Prm2基因的mRNA水平均極顯著低于牦牛（P<0.01），這將影響正常精子發生的過程，推測可能與犏牛雄性不育有一定關系。

關鍵詞：牦牛（Bos grunniens）；雜交雄性不育；睪丸；Prm1；Prm2

中圖分類號：S823.8+5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5375-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.053

Abstract： To elucidate the molecular mechanism of hybrid male sterility of yak， the expressions of two protamines （Prm） between yak and its hybrid （cattle-yak） was compared. Total RNA was extracted from the testes of yaks （n=13） and cattle-yaks（n=7），and quantative PCR analysis showed that the testicular Prm1 and Prm2 mRNA levels in cattle-yaks were significantly lower than those of yaks（P<0.01），which may affect normal spermatogenesis， and thus we speculate that the significantly reduced mRNA levels of the two gene might associate with the male sterility of cattle-yak.

Key words： yak（Bos grunniens）； hybrid male sterility； testis； Prm1； Prm2

牦牛（Bos grunniens）是適應青藏高原低氧環境的特有牛種。牦牛與普通牛的雜交后代（稱犏牛）在產乳、產肉等方面具有明顯的雜種優勢，但表現為回交三代內雄性不育[1]，而雌性雜交后代生殖正常，其分子機制一直未闡明。研究表明，很多基因在犏牛睪丸中的mRNA水平都低于其親本牦牛和黃牛，如SYCP3、Boule、Dazl、Dmc1等基因[2-4]。牦牛和犏牛睪丸蛋白質組學研究也發現，與牦牛相比，犏牛睪丸中大多數蛋白質表達下調[5]。

精蛋白（Protamine）是在精子細胞形成后期合成的，富含精氨酸，是主要的精子核蛋白，能結合DNA并使精子細胞基因組濃縮為非活性狀態[6]。哺乳動物中包括精蛋白1（P1）和精蛋白2（P2）家族研究的最多，分別由Prm1和Prm2基因編碼，前者存在于所有哺乳動物中，包裝精子DNA；而Prm2僅存在于靈長類、多數嚙齒類和其他胎盤哺乳類亞類中，是精子發揮功能所必需的[6]。人類精子中Prm1與Prm2基因的表達水平相近，二者比例的升高或降低均可能與男性不育關聯[7]。本研究對成年牦牛和雄性不育犏牛睪丸中Prm1和Prm2基因mRNA水平進行定量PCR檢測，以探索其與犏牛雄性不育之間的關系。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

選擇健康的成年麥洼牦牛13頭和成年雄性不育犏牛7頭（公黃牛與母麥洼牦牛的雜交后代），于秋季屠宰時迅速采集睪丸，縱切面剖開成若干小塊后用干冰帶回實驗室，-80 ℃保存備用。

1.2 試劑與儀器

試劑：Trizol Reagent購自美國Ambion公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Thermo Scientific公司；QuantiFast SYBR Green PCR Kit購自德國QIAGEN公司。

儀器：C1000 Thermal Cycler梯度PCR儀、C1000 Touch Thermal Cycler熒光定量PCR儀、Versa Doc 1000凝膠成像系統均為美國Bio-Rad公司產品。

1.3 睪丸總RNA的提取及反轉錄

按照試劑盒說明書用Trizol法提取牦牛和犏牛睪丸總RNA，經核酸蛋白檢測儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度和質量。用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit以2 μg總RNA為模板，利用隨機引物進行反轉錄得到cDNA備用。

1.4 睪丸Prm1和Prm2基因的定量分析

以普通牛Prm1（NM_174156）、Prm2（NM_174157）和普通牛內參基因GAPDH （NM_001034034）、18s RNA（NR_036642）為模板，設計定量PCR引物（表1）。對2個目的基因和2個內參基因進行PCR擴增，產物純化后經10倍梯度稀釋作為模板，進行實時熒光定量PCR擴增，并用定量PCR儀上的軟件繪制標準曲線。

以反轉錄的牦牛和犏牛睪丸cDNA為模板，采用熒光定量PCR方法分析Prm1基因和Prm2基因的相對表達量。25 μL的熒光定量PCR體系包括：2×Quanti Fast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL、上、下游引物各1 μL、模板cDNA 1 μL、RNase-free water 9.5 μL。PCR條件：95 ℃預變性5 min； 95 ℃變性15 s，64 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環；65 ℃～95 ℃制作融解曲線。

1.5 數據統計

采用2-△△Ct法計算Prm1和Prm2基因在睪丸中的相對表達水平[8]。用雙內參GAPDH和18sRNA的幾何平均數進行標準化，以牦牛睪丸的表達量為對照。試驗數據用平均值±標準誤表示，用SPSS18.0軟件對熒光定量數據進行t檢驗。

2 結果與分析

2.1 檢測Prm1和Prm2 mRNA水平的熒光定量PCR方法建立

本試驗提取的牦牛和犏牛睪丸RNA質量經核酸蛋白檢測儀和瓊脂糖凝膠電泳分析，質量均符合要求。試驗建立了分析牦牛和犏牛Prm1和Prm2基因mRNA相對水平的定量PCR方法，并采用雙內參基因的幾何平均數進行標準化。目的基因和內參基因擴增特異性高（圖1），擴增效率為93.7%～95.1%，標準曲線線性關系較好（R2>0.99），符合定量要求。

2.2 牦牛和犏牛睪丸中Prm1和Prm2基因mRNA相對表達量的比較

對成年牦牛和雄性不育犏牛睪丸中Prm1和Prm2基因mRNA水平的熒光定量PCR分析結果表明，犏牛睪丸中Prm1和Prm2基因mRNA水平均極顯著低于牦牛（P<0.01），兩個基因在犏牛睪丸中均僅有微弱的表達（圖2）。

3 討論

犏牛的雜種優勢在生產實際中具有重要的價值，但其雄性不育制約了犏牛的有效利用。很多研究證實犏牛睪丸和附睪中無精子[1，9]。犏牛精子發生受阻很可能與減數分裂異常有關。已有研究表明，犏牛睪丸中很多基因的表達下調[2-5]，但這與其雄性不育的因果關系仍不清楚。Prm1和Prm2基因在人睪丸中僅表達于圓形和長形精子細胞中，而不存在于精原細胞、精母細胞和Sertoli等細胞中[10]。有報道表明，人Prm1和Prm2基因存在單核苷酸多態性，與男性不育存在一定關系，且研究結果提示減數分裂前期停滯可能導致精蛋白表達的大幅度下降[11]。犏牛雄性不育很可能與減數分裂異常有關，其睪丸中極低水平的Prm1和Prm2表達可能與此有類似的機制。另外，犏牛睪丸中的細胞組成明顯不同于成年牦牛[9]，根據Prm1和Prm2基因在人睪丸細胞中的表達特征[10]，其Prm1和Prm2表達水平也會顯著下降。

在人類中精蛋白基因突變、表達異常與男性不育存在顯著的關聯[12]。精蛋白基因進化快，牦牛Prm1和Prm2基因序列及表達調控需要進一步研究，以全面闡明犏牛精子發生障礙的詳細分子生物學機制。

參考文獻：

[1] 張旭靜.牦牛和普通牛種間雜種公牛睪丸的組織學觀測與研究[J].畜牧獸醫學報，2001，32（4）：314-318.

[2] 屈旭光，李齊發，劉振山，等.牦牛、犏牛睪丸組織中SYCP3基因mRNA表達水平研究[J].畜牧獸醫學報，2008，39（8）：1132-1136.

[3] 付 永，魏雅萍，吳克選，等.Real-time PCR檢測黃牛、牦牛、犏牛睪丸組織中Boule、Dazl基因mRNA表達[J].生物技術通報，2012（10）：150-155.

[4] 李 賢，李齊發，趙興波，等.牦牛和犏牛Dmc1基因序列分析及睪丸組織轉錄水平研究[J].中國農業科學，2010，43（15）：3221-3229.

[5] 付 偉，李彩霞，劉文靜，等.利用雙向電泳-質譜技術鑒定牦牛和犏牛睪丸中的差異表達蛋白質[J].西南民族大學學報（自然科學版），2014，40（1）：11-15.

[6] BALHORN R. The protamine family of sperm nuclear proteins[J].Genome Biology，2007，8（9）：90-105.

[7] FRANCIS S，YELUMALAI S，JONES C，et al. Aberrant protamine content in sperm and consequential implications for infertility treatment[J].Humman Fertility（Camb），2014，17（2）：80-89.

[8] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-Ct method[J]. Methods，2001，25：402-408.

[9] LOU Y N，LIU W J，WANG C L，et al. Histological evaluation and Prdm9 expression level in the testis of sterile male cattle-yaks[J]. Livestock Science，2014，160：208-213.

[10] WYKES S M，NELSON J E，VISSCHER D W，et al. Coordinate expression of the PRM1，PRM2，and TNP2 multigene locus in human testis[J].DNA and Cell Biology，1995，14（2）：155-161.

[11] GRASSETTI D，PAOLI D，GALLO M，et al. Protamine-1 and -2 polymorphisms and gene expression in male infertility： An Italian study[J].Journal Endocrinological Investigation，2012， 35（10）：882-888.

[12] OLIVA R. Protamines and male infertility[J].Human Reproduction Update，2006，12（4）：417-435.