枯草芽孢桿菌BS—8D防治玉米紋枯病的田間試驗效果及作用機理

摘要：從玉米植株的莖基部葉鞘分離得到枯草芽孢桿菌菌株（Bacillus subtilis BS-8D）。田間小區防病試驗結果表明，該菌株對玉米紋枯病有較好的防效。采用抗利福平標記突變菌株BS-8Drif測定其定殖能力，結果顯示該菌株在玉米葉鞘上有較好的定殖能力，施用10 d后仍能保持較高密度。對BS-8D菌株拮抗機理研究發現，菌株無菌培養液能抑制玉米紋枯病菌（Rhizoctoia solani）核萌發和菌絲生長。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；玉米紋枯病；生物防治；抗菌物質；田間試驗

中圖分類號：S435.131；S476+.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5252-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.022

Abstract：Antagonistic agents of Bacillus subtilis BS-8D was isolated from the sheaths and rhizosphere of corn. The results showed that the strain BS-8D could control effectively corn sheath blight caused by the Rhizoctonia solani in field. BS-8D could colonize， propagate and remain high population at sheaths for more than ten days. The highest colonizing level was reached on 10th day after inoculation. The mechanism study of BS-8 d antagonism showed that the culture filtrate from BS-8D had a strong inhibiting activity against Rhizoctoia solani sclerotium germination and the growth of mycelia.

Key words： Bacillus subtilis； maize sheath blight； biocontrol； antagonistic substance； field experiment

玉米紋枯病主要是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的土傳病害[1-3]，該病菌侵染玉米基部葉鞘并向上部葉鞘發展，可危害莖稈和果穗，其典型癥狀是形成不規則的云紋狀病斑，嚴重時造成玉米減產。該病已成為玉米上的主要病害之一。由于缺乏高抗玉米品種，生產上對紋枯病的防治主要施用井岡霉素[4]，由于防治方法單一，容易使病原菌產生抗藥性[5]。因此，急需尋找其他有效、環保的防治途徑。

本研究測定了枯草芽孢桿菌BS-8D菌株培養液對玉米紋枯病的田間小區防治效果，并通過該菌株在玉米葉鞘定殖的消長情況，對其作用機理作初步研究，以期為玉米紋枯病的防治提供新的方法和參考。

1 材料與方法

1.1 培養基與試劑

培養基有營養肉湯培養基（NA）、營養肉湯瓊脂培養基（NA）、馬鈴薯葡萄糖培養基（PD）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA），均由北京三藥科技開發公司提供。井岡霉素5%水劑（使用時配成1 000倍稀釋液），由武漢科諾生物技術股份有限公司提供。

1.2 供試材料與試驗菌

供試玉米為川單15號，精選、催芽，選取發芽一致的種子備用。

拮抗菌菌液制備：菌株為四川農業大學植物病理系分離得到的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis BS-8D）。將菌株接種到營養肉湯培養基中，于35 ℃、120 r/min振蕩培養72 h，制成菌體濃度約為107 CFU/mL的懸液，備用。

病原菌接種體制備：玉米紋枯病病原菌（AG1-IA）為四川農業大學植物病理系提供的強致病菌株。采用麥粒培養基，將R. solani在PDA平板上活化后，用內徑5 mm打孔器打孔，將菌絲圓片接種到盛有滅菌麥粒的三角瓶中。28 ℃培養7 d左右，待菌絲在麥粒上充分生長后，作接種體用。

1.3 田間小區防病效果試驗

試驗設3種處理：①土壤接種病原菌處理（CK）：將病原菌麥粒接種體施入到玉米窩內土壤中，均勻分散于表層6 cm范圍內，每窩15 g，播種后覆土；②土壤接種病原菌+拮抗菌菌液拌種處理（BS-8D）：接種病原菌后，種子用拮抗菌菌液拌種4 h后播種；③土壤接種病原菌+井岡霉素拌種處理（井岡霉素）：接種病原菌，種子用井岡霉素拌種后播種。每處理小區面積為6.0 m×6.0 m，重復2次。種植方式采用窩距50 cm，行距50 cm，每窩播種5粒，出苗后間苗為2 株/窩，每小區242株。試驗1年1次，重復2年。

苗期處理：待玉米植株長到4葉期，各處理分別用清水、拮抗菌液和井岡霉素均勻噴施植株基部。

成株期處理：待植株生長到拔節前期和喇叭口期時，再次噴施，方法同苗期。

病情調查：待植株抽穗后，調查病斑上升的葉鞘位，按以下5級標準記載病級[6]。0級，全株不發病；1級，果穗位下第4葉鞘及以下葉鞘發病；2級，果穗位下第3葉鞘及以下葉鞘發病；3級，果穗位下第2葉鞘及以下葉鞘發病；4級，果穗位下第1葉鞘及以下葉鞘發病；5級，果穗位及以上葉鞘發病。

1.4 拮抗菌株在玉米葉鞘上的消長動態測定

1.4.1 抗藥性菌株的篩選和標記 為研究拮抗菌株在田間玉米葉鞘上的消長動態，進行了抗利福平標記[7]。拮抗菌培養72 h，將菌懸液涂抹于NA平板上，在黑暗條件下用40 W紫外燈距離40 cm照射3～10 min，以95%菌體死亡為最佳處理時間。經誘變后的菌株在無光條件下培養，以后接種到含利福平的營養肉湯培養基中培養；再逐步接種到含利福平濃度逐級升高的培養基上，最后純化培養于含300 μg/mL利福平的NA平板培養基上。挑單菌落純化3次，選取拮抗性穩定的作為供試菌的抗利福平標記菌株。

1.4.2 標記菌株在葉鞘上的動態消長測定 取在營養肉湯培養基中培養72 h的利福平標記菌株的菌液（濃度約為107 CFU/mL），加0.1%的吐溫-20（以增強展著力），噴霧接種于抽雄期玉米植株近地面健康葉鞘上，處理后1 h，取樣分離作為初始菌量，以后分別在處理后2、4、6、8、10、12、16、18 d，取樣分離1次，直至葉鞘表面菌量大幅下降為止。每次取樣時用無菌刀片隨機在各植株噴菌于葉鞘表面，共劃取10塊2.0 cm×3.0 cm大小的組織，剪碎后用50 mL無菌生理鹽水振蕩洗滌30 min，梯度稀釋，取0.1 mL不同稀釋度洗滌液涂布于含利福平濃度為300 μg/mL的NA平板培養基上，每稀釋梯度3皿，35 ℃下培養72 h，記載菌落數。菌量用CFU/cm2表示，根據接種后測定時間和所測得的菌量繪制出標記菌株的種群消長曲線。

1.5 拮抗菌株無菌濾液對R. solani菌核萌發的影響

將已融化的瓊脂均勻涂布于無菌載玻片上，待其凝固后，放在無菌培養皿內的兩支玻璃棒上，每皿兩片。皿內加5 mL無菌水保濕。選大小基本一致的PDA平板新培養的R. solani菌核依次經75%乙醇、0.1%升汞表面消毒5～30 s后，經無菌水洗滌，稍晾干，再于拮抗菌培養72 h的無菌濾液和營養肉湯培養基（CK）中浸潤10 s，然后放在瓊脂玻片上，每片5粒，粒距1.5 cm，每處理12片（60粒）。蓋上培養皿蓋，28 ℃培養，分別于48、72、85 h后鏡檢萌發情況。

萌發菌絲指數測定[8]：在玻片背面以菌核為圓心半徑為2 mm劃一圓圈，低倍鏡下觀察，自菌核長出圈外者定為萌發菌絲，萌發菌絲按以下標準分6級。0級，萌發核絲數為0；1級，萌發菌絲數為1～20；2級，萌發菌絲數為21～50；3級，萌發菌絲數為51～80；4級，萌發菌絲數為81～140；5級，萌發菌絲數≥141。按以下公式計算萌發菌絲指數。

1.6 無菌濾液對R. solani的抗生作用

將拮抗菌BS-8D培養72 h的無菌濾液按10%比例加入到無菌PD培養基中，然后接種生長旺盛的R. solani菌絲塊，于28 ℃下培養8 d，挑取少許培養的菌絲，用棉藍乳酚油染色，在光學顯微鏡下觀察菌絲形態等特征。

2 結果與分析

2.1 田間小區防病效果

BS-8D菌株對成株期玉米紋枯病的防治效果見表1。從病情擴展速度看，BS-8D菌液處理與對照相比，病斑上升到的葉鞘位平均降低1.2 cm左右；從病情指數上看，BS-8D菌液處理低于對照，差異達顯著水平，相對防效為41.12%。而BS-8D處理植株與井岡霉素處理相比，病情指數高于井岡霉素，且差異顯著，其相對防效低于井岡霉素的63.01%。說明BS-8D菌株在田間具有一定的防病效果，但效果較井岡霉素仍有一定差距。

2.2 拮抗菌株在玉米葉鞘上消長動態的測定

2.2.1 抗藥性菌株的篩選和標記 通過利福平從低濃度到高濃度逐級誘變及誘變后的拮抗性檢測，獲得了耐利福平濃度300 μg/mL的突變株BS-8Drif。

2.2.2 標記菌株在玉米葉鞘上的動態消長測定 拮抗菌BS-8Drif在田間玉米葉鞘上的定殖、消長動態見圖1。接種后，葉鞘上菌量呈明顯下降趨勢，第4 天下降了69.7%，這段時間稱為適應期。此后，菌量逐步上升，至第8天菌量達到最高，是初始帶菌量的1.91倍，這段時間稱為繁殖期。此后，菌量呈下降趨勢。可見菌株在葉鞘表面維持較高數量可達10 d以上。

2.3 拮抗機理的探討

2.3.1 無菌濾液對R. solani菌核萌發的影響 BS-8D無菌培養液對R. solani菌核萌發的影響見表2、圖2。由表2可知，培養72 h后，菌核萌發指數和菌落直徑分別比對照降低98.11%和57.41%，培養85 h后，抑制作用也十分明顯，兩項指標與對照相比分別降低60.04%和30.80%。由圖2可以看出，菌核用BS-8D無菌濾液處理后，72 h內未觀察到菌核萌發，85 h后可見少量菌絲萌發，而對照處理72 h時已大量萌發。

2.3.2 抗菌物質對R. solani的抗生作用 顯微觀察發現，R. solani正常菌絲為淡褐色至褐色（圖3-A）。經BS-8D無菌濾液作用后的R. solani菌絲，在拮抗菌BS-8D的作用下，菌絲顏色加深，壁加厚，有些菌絲膨大內部形成球狀顆粒（圖3-B）；有些菌絲隔膜增加，菌絲變為橢圓形或念珠狀（圖3-D）；有些菌絲變粗，細胞壁被破壞，原生質外溢而造成菌絲空殼（圖3-C、圖3-D）；有些菌絲細胞出現畸形、裂解和斷裂（圖3-D）。

3 小結與討論

本研究從玉米植株根際分離到拮抗玉米紋枯病菌的芽孢桿菌菌株BS-8D，解決了外來菌株難于在作物上定植的問題。田間小區試驗、葉鞘定植試驗表明，該菌株對玉米紋枯病有較好的防病效果，能在葉鞘表面定植較長時間，說明與病原菌有相似的生態適應性。采用噴施BS-8D菌懸液防治紋枯病，其防效與當前主流農藥井崗霉素相比仍有一定差距，說明還需要進一步研究，如施用方式、施用濃度、有效成分、菌劑制作等。因此，未來仍需通過不同地域大面積田間試驗來進一步證明其實用效果，并篩選拮抗菌田間施用的最佳濃度，在此基礎上開展菌株的遺傳穩定性、對人畜的安全性、菌劑的生產等方面的試驗研究工作。

參考文獻：

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