核苷功能菌腺苷超聲提取工藝優化

周新虎，陳　翔，嚴啟梅，楊　勇，李　喆，姜　勇，戴　源，譚洪娣，宋　寶（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

?

核苷功能菌腺苷超聲提取工藝優化

周新虎，陳翔，嚴啟梅，楊勇，李喆，姜勇，戴源，譚洪娣，宋寶
（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

摘要：研究超聲波水提法提取核苷功能菌腺苷的最佳工藝。通過單因素試驗和正交試驗對提取工藝進行優化設計，采用高效液相色譜法測定腺苷含量，考察料液比、超聲提取溫度、超聲提取時間和超聲功率對核苷功能菌腺苷含量的影響。得出影響核苷功能菌腺苷提取效果的先后次序為：提取時間＞料液比＞超聲功率＞提取溫度。最佳提取工藝條件為料液比1/150 g/mL、提取溫度55℃、提取時間20 min、超聲功率350 W。該工藝條件下，核苷功能菌菌絲體中腺苷含量高達435.58 mg/100 g。

關鍵詞：微生物；核苷功能菌；腺苷；超聲提取法；正交試驗設計

核苷功能菌，泛指能夠代謝生成核苷及其類似物的一類微生物，據研究，核苷功能菌可以代謝生成核苷及其類似物、多糖類、D-甘露醇等成分，其中腺苷是核苷功能菌主要活性成分，也是調節睡眠的內穩態因子之一，對人體代謝和生理功能起到重要調節作用[1-3]。

目前，常用高效液相色譜法來檢測腺苷含量，但對于核苷功能菌中腺苷的前處理方法，沒有系統性的研究報道。據相關研究，不同提取方法對腺苷的提取，超聲法的效果遠遠高于回流法和振蕩法；不同提取溶劑（甲醇、乙醇、水）對腺苷提取效果的影響，采用純水提取時腺苷的提取效果最好，雜質干擾少。本實驗結合已有的研究結果，采取超聲提取法，以水為提取溶劑，從料液比、提取溫度、提取時間和超聲功率4個因素優化核苷功能菌中腺苷的前處理，為快速準確測定核苷功能菌中的腺苷含量提供理論參考依據。

1　材料與方法

1.1材料

實驗菌種：本公司技術中心功能微生物實驗室保藏。

1.2耗材及儀器

實驗耗材：腺苷標準品，純度100 mg/L，sigma試劑公司生產；磷酸二氫鉀（分析純），國藥集團化學試劑有限公司生產；甲醛（色譜純），德國merck公司提供；等。

實驗儀器：真空冷凍干燥機，FD-1C-50型，北京博醫康實驗儀器有限公司；冰箱，BCD-649WE型，青島海爾股份有限公司；臺式低速離心機，AXTD5A型，鹽城市安信實驗儀器有限公司；電子天平，AL204型，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；高效液相色譜，HPLC-e2695，美國waters高效液相色譜儀；二極管陣列檢測器，島津公司；一次性使用無菌注射器帶針，圣光醫用制品有限公司；wondaDisc水系針頭濾器MCE25 mm×0.45 μm，島津技邇（上海）商貿有限公司；Millpore超純水系統；KH-500DB型數控超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1菌絲體預處理[4]

將液體深層發酵獲得的核苷功能菌菌絲體經真空冷凍干燥后，粉碎，過80目篩，封口袋保存備用。

1.3.2標樣溶液的制備

準確量取一定體積的100 mg/L的腺苷置于10 mL容量瓶，用超純水溶液溶解定容，分別配制成質量濃度（mg/L）為5、10、15、20、25、30、35、40的腺苷溶液，作為標樣溶液。

1.3.3菌絲體中腺苷的超聲提取方法

準確稱取一定量的已預處理的菌絲體粉末于50 mL容量瓶中，加入45 mL超純水，按試驗設定條件超聲提取腺苷，用超純水定容（腺苷粗提液），振蕩搖勻，以4000 r/min離心5 min，再經0.45 μm微孔濾膜過濾，所得濾液即為菌絲體中腺苷提取液，進行HPLC分析。

1.3.4腺苷的測定方法[5-6]

利用HPLC法測定核苷功能菌菌絲體中腺苷的含有量。流動相為pH6.5的磷酸鹽緩沖液-甲醇(體積比85∶15)；色譜柱為C18，體積流量1 mL/min，檢測波長260 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL。

1.3.5菌絲體中腺苷提取率的計算

腺苷提取率（mg/100g）=腺苷含量(mg/L)×腺苷粗提液體積（mL）×1000/菌絲體質量(g)×100。

1.3.6單因素提取試驗設計

分別以不同的料液比、提取溫度、提取時間、超聲功率作為單因素試驗影響因子，考察各單因素對核苷功能菌菌絲體中腺苷含量的影響。

1.3.7超聲提取工藝正交試驗

根據試驗結果，選擇料液比、提取溫度、提取時間、超聲功率4個因素，各取3個水平，采用L9(34)正交表進行正交試驗，見表1。

表1 超聲提取腺苷正交試驗因子及水平

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1料液比對腺苷提取效果的影響

按照不同的料液比（g/mL）1/50、1/100、1/150、1/200、1/250，稱取適宜的核苷功能菌絲體粉末于50 mL容量瓶中，加入45 mL超純水搖勻，于50℃、350 W條件下超聲20 min，冷卻，用超純水定容至刻度，振蕩搖勻，以4000 r/min離心5 min，再經0.45 μm微孔濾膜過濾，所得濾液進行HPLC分析，結果見圖1。

圖1 料液比對腺苷提取效果的影響

由圖1結果表明，不同料液比對腺苷的提取效果有影響，料液比大，提取效果好。當料液比達到1/150 g/mL時提取效率達到最大值，為402.50 mg/100 g，當料液比為1/200 g/mL時腺苷含量為393 mg/100 g，與料液比1/150 g/mL相比，降低2.36 %，考慮節約提取溶劑，降低提取成本，建議選擇料液比1/150 g/mL。

2.1.2提取溫度對腺苷提取效果的影響

按照1/150的料液比（g/mL）稱取適宜的核苷功能菌菌絲體粉末于50 mL容量瓶中，加入45 mL超純水搖勻，分別于溫度45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，超聲功率為350 W條件下超聲20 min，冷卻，用超純水定容至刻度，振蕩搖勻，以4000 r/min離心5 min，再經0. 45 μm微孔濾膜過濾，所得濾液進行HPLC分析。

圖2 提取溫度對腺苷提取效果的影響

溫度對超聲波提取核苷功能菌絲體粉中腺苷的影響結果見圖2。提高溫度有利于提取腺苷，但溫度過高會使腺苷提取效果變差，腺苷的熱穩定性也隨之變差，因此過高的溫度可能會影響腺苷的提取效果。從圖2可以看出，超聲提取溫度為55℃時，腺苷含量達到最大值422.66 mg/100 g，溫度繼續升高時，腺苷含量出現下降趨勢，因此超聲最佳提取溫度為55℃。張娜等[7]研究指出，隨著超聲提取溫度的升高，白囊耙齒菌絲體中腺苷提取率先升高后降低，本研究結論與其相似。

2.1.3提取時間對腺苷提取效果的影響（圖3）

按照1/150的料液比（g/mL）稱取適宜的核苷功能菌菌絲體粉末于50 mL容量瓶中，加入45 mL超純水搖勻，以50℃、350 W條件下分別超聲10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，冷卻，用超純水定容至刻度，振蕩搖勻，以4000 r/min離心5 min，再經0.45 μm微孔濾膜過濾，所得濾液進行HPLC分析。

圖3 提取時間對腺苷提取效果的影響

超聲提取時間越長，核苷功能菌絲體細胞破碎越充分，細胞內含物質滲出越多，腺苷提取液中水溶性成分含量增加，達到一定時間，絕大多數水溶性成分即可全部提出；但隨著時間的延長，不但細胞破碎率不會提高，甚至會對細胞中生物分子有破壞作用，增加了提取液中干擾物質的量，加大了檢測分析的難度[6]。本實驗結果表明，隨著提取時間的延長，腺苷的含量明顯增加。當提取時間為20 min時，腺苷含量達到最高值，超過25 min后，腺苷含量降低。為提高腺苷提取效率，建議選擇超聲提取20 min為最佳時間。

2.1.4超聲功率對腺苷提取效果的影響

按照1/150的料液比（g/mL）稱取適宜的核苷功能菌絲體粉末于50 mL容量瓶中，加入45 mL超純水搖勻，于溫度55℃、不同超聲功率（W）250、300、350、400、450條件下超聲20 min，冷卻，用超純水定容至刻度，振蕩搖勻，以4000 r/min離心5 min，再經0.45 μm微孔濾膜過濾，所得濾液進行HPLC分析（見圖4）。

圖4 超聲功率對腺苷提取效果的影響

由圖4可知，當超聲功率在200～400 W范圍內，隨著超聲功率的增大，腺苷含量先增加后降低。當超聲功率為350 W時，腺苷含量達到最大值423.89 mg/100 g；當超聲功率為400 W時，腺苷含量反而降低，可能是由于超聲波的強烈空化效應使腺苷結構破壞，導致提取率降低。因此，超聲功率為350 W時，較有利于核苷功能菌絲體中腺苷的提取。

2.2正交試驗結果（表2）

表2 正交試驗及結果

由表2中R值可知，影響核苷功能菌腺苷含量的先后順序是C＞A＞D＞B，即最重要的因素為超聲作用時間，其次是料液比，再次是超聲功率，最后是提取溫度。最佳組合為A2B2C3D1，即提取工藝參數為料液比1/150 g/mL、提取溫度55℃、提取時間25 min、超聲功率300 W。將此結果與單因素試驗篩選出的最佳條件組合分別進行驗證試驗，試驗結果見表3。

表3 驗證試驗結果(n=3)

由表3驗證試驗結果可知，核苷功能菌腺苷超聲提取的最佳工藝組合為A2B2C2D2，即料液比1/150 g/mL、提取溫度55℃、提取時間20 min、超聲功率350 W，得到核苷功能菌腺苷最高值435.58 mg/100 g，RSD為1.23 %。

2.3超聲提取法與常規提取法的比較

準確稱取一定量預處理后的核苷功能菌粉末，固定料液比、提取溫度（室溫浸提除外），適當延長室溫浸提和熱浸漬法的提取時間，測定3種提取法核苷功能菌腺苷的含量，試驗條件及結果見表4。

表4 超聲提取法與常規提取法的比較

由表4可知，超聲提取法較常規提取法有較大優勢，腺苷含量分別高于常規提取法室溫浸提法的157.8 %，熱浸提取法的9.18 %，而且縮短了整個工藝的提取時間，為工業化生產提供了參考依據。

3　結論

本實驗通過單因素試驗和正交試驗，采用超聲法提取核苷功能菌腺苷含量。實驗結果表明，影響超聲提取核苷功能菌腺苷含量的4個因素先后順序為超聲提取時間＞料液比＞超聲功率＞提取溫度。得到的最佳工藝參數為料液比1/150 g/mL、提取溫度55℃、提取時間20 min、超聲功率350 W。在該條件下核苷功能菌腺苷含量435.58 mg/100 g，RSD為1.23 %。與常規提取方法相比，超聲提取法簡單易行、效率高、提取時間短，是一種提取核苷功能菌腺苷的有效途徑，具有推廣應用的價值。

參考文獻：

[1]張元杰,錢正明,陳肖家. HPLC法同時測定補益中藥中尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷的含量[J].藥物分析雜志,2010, 30(1)：33-36.

[2]江元翔,高淑紅,陳長華.響應面設計法優化腺苷發酵培養基[J].華東理工大學學報：自然科學版,2005,31(3)：309-313.

[3] Cui F L, Wang J L, Cui Y R, et al. Investigation of interaction between human serumalbumin and N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine by fuorescence spectroscopy and molecular modelling[J]. Luminescence 2007,22：546-553.

[4]張娜,郭嬌,季文彬,等.響應面法優化白囊耙齒菌中腺苷的超聲法提取工藝[J].中國醫藥工業雜志,2011,42(2)：100-103.

[5]張命龍,焦春偉,謝意珍,等.蝙蝠蛾擬青霉液體發酵工藝優化及菌絲體腺苷含量的檢測[J].菌物學報,2016,35(1)：1-14.

[6]張博,楊黎彬,李金娟.高效液相色譜法測定擬青霉中活性成分腺苷的含量[J].今日藥學,2011,21(2)：25-26.

[7]張娜,周衛,王文溪,等.響應面法優化白囊耙齒菌中腺苷的提取工藝[J].中國生化藥物雜志,2011,32(5)：370-373.

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Adenosine from Nucleoside Functional Bacteria

ZHOU Xinhu, CHEN Xiang, YAN Qimei, YANG Yong, LI Zhe, JIANG Yong, DAI Yuan, TAN Hongdi and SONG Bao
(Yanghe Distillery Co.Ltd., Suqian, Jiangsu 223800, China)

Abstract:The ultrasonic-assisted extraction conditions of adenosine from nucleoside functional bacteria were optimized by single factor test and orthogonal experiments. Adenosine content was measured by HPLC. The effects of solid-liquid ratio, extraction temperature, ultrasonic extraction time and ultrasonic power on adenosine content were investigated. The factors influencing adenosine extraction ranked in decreasing sequence as follows: extraction time>solid- liquid ratio>ultrasonic power>extraction temperature. The optimum technical parameters were summed up as follows: solid-liquid ratio was 1/150 g/mL, extraction temperature at 55℃, ultrasonic extraction time was 20 min, and ultrasonic power was 350 W. Under above conditions, the content of the extracted adenosine from nucleoside functional bacteria reached up to 435.58 mg/100 g.

Key words:microbe; nucleoside functional bacteria; adenosine; ultrasonic-assisted extraction; orthogonal experiments design

作者簡介：周新虎（1962-），男，江蘇宿遷人，漢族，碩士，高級工程師，江蘇洋河酒廠股份有限公司副總裁、總工程師，白酒國家評委，中國首席品酒師、中國評酒大師，曾獲全國五一勞動獎章，江蘇省突出貢獻專家等榮譽稱號。

收稿日期：2015-12-16

DOI：10.13746/j.njkj.2015468

中圖分類號：TS262.3；Q93-3；TS261.1；TS261.7

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016)04-0070-04

優先數字出版時間：2016-02-02；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160202.1542.005.html。