高效液相色譜法測定木薯干中黃曲霉毒素B1的不確定度評定

宋衛得，厲雪芹，高堯華，劉培海，劉　冰，盧志曉，孫　燦（日照出入境檢驗檢疫局，山東日照276826）

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高效液相色譜法測定木薯干中黃曲霉毒素B1的不確定度評定

宋衛得，厲雪芹，高堯華，劉培海，劉冰，盧志曉，孫燦
（日照出入境檢驗檢疫局，山東日照276826）

摘要：依據GB/T18979—2003《食品中黃曲霉毒素的測定》，對免疫親和層洗凈化高效液相色譜法測定木薯干中黃曲霉毒素B1的不確定度進行了評定。對檢測過程中產生的不確定分量進行了分類，計算各分量的相對標準不確定度，從而計算出合成標準不確定度和擴展不確定度。通過評估發現，對測定不確定度影響最大的分量是檢測方法的回收率，影響最小的分量是樣品質量的稱量，合成相對標準不確定度為10.5 %。

關鍵詞：液相色譜；黃曲霉毒素；不確定度；木薯干

黃曲霉毒素是黃曲霉菌的次級代謝產物，其中最具威脅的是具致癌性的黃曲霉毒素B1，主要作用于肝臟，產生致癌、致畸、致突變等嚴重危害[1-4]。目前，世界各國和地區對食品中黃曲霉毒素均有明確的限量要求[5]。我國食品安全標準中規定，木薯干中黃曲霉毒素B1的限量為5.0 μg/kg。木薯干作為制造酒精及檸檬酸的重要原料[6]，由于國內原料的短缺，釀酒企業對木薯干需求量旺盛，進口木薯干規模和數量巨大，其毒素污染狀況直接關乎釀酒產品質量和釀酒企業效益。本文以最新的不確定度評定標準為依據，結合實驗室具體測定方法，對高效液相色譜法測定木薯干中黃曲霉毒素B1的不確定度進行評定，為食品和釀酒企業檢測人員進行相關不確定度評定提供參考。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

高效液相色譜儀Agilent 1260(熒光檢測器FLD）；黃曲霉毒素免疫親和柱（北京中檢維康公司）；黃曲霉毒素B1標準品(Sigma公司），1.055 μ g/mL，誤差范圍±0.002 μg/mL；甲醇(色譜純)，美國J.T.Baker。

1.2檢測方法

本實驗室測定木薯干中黃曲霉毒素參照GB/T 18979—2003進行，并對某些步驟進行了優化和改進，檢測結果滿意。

實驗步驟：稱取25.0 g粉碎樣品，加入5 g NaCl及（8∶2）甲醇-水至100 mL，以均質器高速攪拌提取2 min。定量濾紙過濾，準確移取5.0 mL濾液并加入20 mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾。將免疫親和柱連接于20.0 mL注射器下，準確移取10.0 mL樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與注射器連接，調節壓力使溶液以6 mL/min流速通過過免疫親和柱，直至2～3 mL氣體空氣通過柱體。以10 mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并將2～3 mL氣體空氣通過柱體。準確加入1.0 mL色譜級甲醇洗脫，流速為1～2 mL/min，收集全部流出液于玻璃試管中，再加入去離子水定容1 mL淋洗柱，最后用甲醇-水（1∶1）定容至2 mL，待上機檢測。

1.3不確定度來源

本方法操作步驟相對復雜，影響因素多，不確定來源主要包括：（1）樣品制備均勻度引入的不確定度；（2）稱量、定容等引入的不確定度；（3）標準溶液及配制產生的不確定度；（4）檢測方法回收率引入的不確定度；（5）環境溫度影響的不確定度。

2　不確定度的評定

2.1樣品均勻度引入的不確定度

被測試樣品各部位含有黃曲霉毒素的差異較大，本實驗按照標準取樣方法，分別抽取10個混合樣品進行測定，以評定試樣制備的均勻度。該不確定度評定屬A類評定，可由全部10個不同混合試樣測定結果進行統計分析得出。

本實驗以木薯干中黃曲霉毒素B1為例，將10個混合樣品分別粉碎、充分搖勻后依次進行測定，測試數據見表1。

表1 黃曲霉毒素B1的測試數據　(μg/kg)

黃曲霉毒素B1含量的平均值：x=4.79 μg/kg。

單次測定∑標準差s(xi)用貝塞爾公式計算：

樣品分布均勻度引入的標準不確定度u(x)為：

2.2樣品稱量不確定度

2.3樣品定容不確定度

2.3.1由校準引入的標準不確定度u(V1)

樣品經粉碎、提取、凈化后準確加入1 mL甲醇洗脫，加入去離子水定容至2 mL，使用吸管獲得該體積，依據JJG196—2006《常用玻璃量具檢定規程》，2 mL吸管檢定后給出的允許誤差為±0.010 mL，按B類評定，假設服從均勻分布，置信因子k=，則由校準引入的標準不確定度u(V1)為：

2.3.2由溫度變化引入的標準不確定度u(V2)

實驗室的溫度在20℃±4℃間變化，水的體積膨脹系數為2.1×10-4/℃，由此引入的標準不確定度為：

相比之下，體積由校準帶來的不確定度分量遠高于溫度波動引入的不確定度分量，因此后者可以忽略。體積的標準不確定度為u(V)=0.0058 mL。

2.4標準品工作液濃度不確定度的評定

2.4.1標準品濃度引入的不確定度

本方法采用的標準品1 mL液體試劑，黃曲霉毒素B1濃度為1.055 μg/mL，需經2次稀釋配制為標準工作液。標準證書標明黃曲霉毒素B1濃度c0為1.055 μg/mL，誤差范圍±0.002 μg/mL，則該標準品濃度不確定度可按B類評定，同樣按照矩形分布處理，其標準不確定度u(c0)為：

2.4.2標準工作液配制引入的不確定度

黃曲霉毒素標準品經2次稀釋配制為標準工作液，即將1 mL標準品定容于10 mL容量瓶中，用苯-乙腈（98 ∶2）定容至刻度，充分混勻得到標準儲備液；準確移取1 mL標準儲備液于10 mL容量瓶中，用苯-乙腈（98∶2）定容至刻度，充分混勻得到標準工作液。

即：V1=1 mL，V2=10 mL，V3=1 mL，V4=10 mL。

標準工作使用液的濃度c：

依據JJG 196—2006《常用玻璃量具檢定規程》，A級1 mL吸管，最大允許誤差為：±0.007 mL；A級10 mL容量瓶，最大允許誤差為：±0.020 mL。按均勻分布處理，由校準導致的標準不確定度分別為：

由于稀釋操作時，吸管和容量瓶中的溶液幾乎處于相同的溫度下，因此可以忽略溫度帶來的影響。另外重復性已包括在樣品均勻度的試驗中。

表2 黃曲霉毒素含量檢測的各不確定度分量

2.4.3合成標準樣品工作液配制的不確定度

由此導出標準工作液配制的標準不確定度u(c)為：

2.4.4檢測方法的不確定度

根據食品理化部分的實驗室質量控制規范，當被測組分含量＜0.1 mg/kg時，回收率范圍60 %～120 %[7]。經過本實驗室的大量添加回收率試驗數據結果證明，當添加濃度在0.001～0.01 mg/kg時，該方法的回收率控制在70 %～105 %范圍之內，符合實驗室質量控制規范的要求。因此我們以該數據作為評定該檢測方法不確定度的依據。該不確定度可包含整個檢驗方法過程中的提取、凈化、淋洗、濃縮、定容及儀器分析等各個操作步驟在常規操作下產生的誤差來源。

根據統計數據回收率的上界為a+=105 %，其下界為a-=70 %，其區間半寬度為a=(a+-a-)/2=(105 %-70 %)/2= 17.5 %，服從均勻分布，置信因子k=。由此引起的標準不確定度為：

大量的回收率數據所表征的方法已包括了重復性引入的不確定度，故不重復評定。回收率實驗中，試樣的主要作用是產生一個與實際檢測過程相同的載體條件。回收率實驗中沒有包含全部實驗室偏倚分量，對能夠產生偏倚的量，已在上述不確定度分量評定中進行了單獨的分析討論。

3　標準不確定度各分量的評估分析

通過表2中各不確定度分量的大小對比發現，不確定度的最大貢獻來自于測試方法的回收率，其次是取樣時樣品分布均勻度，貢獻最小的是樣品質量的稱量，后者在計算合成不確定度時可以忽略不計。

4　合成相對標準不確定度

5　合成標準不確定度

6　擴展不確定度與測試結果報告

取包含因子k=2，測試結果y的擴展不確定度：

U=kuc(y)=2×0.50=1.00 μg/kg。

測定結果報告為：y=(0.479±1.00)μg/kg，k=2。

7　討論

本研究以木薯干中黃曲霉毒素B1的10次取樣測定數據為基礎，進行了免疫親和層洗凈化高效液相色譜法測定黃曲霉毒素的不確定度評定。從中發現，影響方法不確定度的主要因素是測試方法回收率和樣品分布均勻性。因此，在同等實驗操作條件下，選用性能穩定的免疫親和凈化柱和科學準確的取樣方法是保證黃曲霉毒素測定結果準確性的前提。

一切測試結果都不可避免地產生不確定度，測試結果的可靠性取決于不確定度的大小，只有出具不確定度值，檢測結果才完整而有意義。在本實例檢測中，黃曲霉毒素B1平均測試結果為4.79 μg/kg，未超過國標限量；但加入擴展不確定度值后，黃曲霉毒素B1的濃度已超過國標限量值5.0 μg/kg，不能判定為合格，可作為木薯干進口企業應對貿易糾紛、進行維權的技術指標。

參考文獻：

[1]李瑞芳，韓北忠，陳晶瑜，等.黃曲霉生長預測模型的建立及其在玉米儲藏中的應用[J].中國糧油學報，2008，23（3）：144-147.

[2]羅小虎，王韌，王莉，等.黃曲霉毒素檢測方法研究進展[J].糧食與飼料工業，2013(10)：54-58.

[3]許艷麗，鮑蕾，梁成珠，等.黃曲霉毒素檢測及其生物防治方法的研究進展[J].安徽農業科學，2007，35(32)：10210-10212.

[4]田瑞紅，孫建平.HPLC技術分析測定黃曲霉毒素的研究進展[J].食品研究與開發，2015，36(6)：149-152.

[5]郭禮強，宮小明，孫軍，等.高效液相色譜-質譜法同時測定曲霉菌代謝物中的黃曲霉毒素及其同系物[J].分析試驗室，2015，34（6）：677-682.

[6]韋昌聯，盧柳忠，黎貞崇.我國木薯生物質能源產業發展現狀與科技需求[J].釀酒科技，2012（7）：108-111.

[7]全國認證認可標準化技術委員會.實驗室質量控制規范食品理化檢測：GB/T 27404—2008[S].北京：中國標準出版社，2008.

Evaluation of the Uncertainties in the Determination of Aflatoxins B1in Dry Cassava by HPLC

SONG Weide, LI Xueqin, GAO Yaohua, LIU Peihai, LIU Bing, LU Zhixiao and SUN Can
Rizhao Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau, Rizhao, Shandong 276826, China)

Abstract:The uncertainties in the determination of aflatoxins B1in dry cassava by HPLC according to GB/T 18979-2003 were evaluated. The uncertainty components were classified, the relative standard uncertainty of each component was calculated, and the combined standard uncertainty and expanded uncertainty were calculated eventually. The evaluation results suggested that the component with the maximum uncertainty influence was recovery rate and the component with the minimum uncertainty influence was sample weighing, with the relative combined standard uncertainty of 10.5 %.

Key words:liquid chromatography; aflatoxins; uncertainty ; dry cassava

作者簡介：宋衛得(1981-)，男，山東日照人，工程師，碩士，主要從事食品檢驗及質量控制工作，E-mail：woxinyh2006@163.com。

收稿日期：2015-11-03；修回日期：2015-12-07

基金項目：山東出入境檢驗檢疫局科研計劃項目（SK201619）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015415

中圖分類號：TS261.2；TS261.7

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）04-0093-03

優先數字出版時間：2016-02-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160225.1713.002.html。