水曲柳復幼——微繁技術研究*

薛文輝　詹亞光　何利明　朱　珠　于　磊

（東北林業大學生命科學學院，黑龍江　哈爾濱　150040）

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水曲柳復幼——微繁技術研究*

薛文輝詹亞光**何利明朱珠于磊

（東北林業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱150040）

摘要：采用截干、噴施激素、掩埋鋸末三種處理方式對水曲柳2年生幼苗進行復幼處理，并以萌生枝條的頂芽及腋芽作為外植體，探討最佳復幼——微繁體系，結果表明：（1）截干+噴施激素處理的幼苗產生的穗條數量、長度及直徑均優于其它處理，每株幼苗當年可產出6～7條可供嫁接的穗條和20個左右莖節外植體（水曲柳對照平均為4～5個）。（2）復幼處理獲得的萌條莖節進行組織培養時，新芽啟動率和增殖系數均超出對照，其中截干+噴施BA組合最為突出，啟動率超出對照的132%，而截干+噴施激素+掩埋鋸末初代增殖系數最高，超出對照65.2%。（3）經隸屬函數評分排序，選出附加ZT 1.0 mg/L和2%蔗糖的WPM培養基最有利于新芽分化，增殖系數達到9.61，與其它處理差異顯著。

關鍵詞：水曲柳；促萌；復幼；微繁

*國家科技支撐項目（2012BAD01B0503）和國家自然科學基金課題（31270697）資助

水曲柳（Fraxinus mandshurica）為木犀科白蠟屬落葉喬木，我國二級重點保護野生植物。水曲柳在我國北方地區分布廣泛，既是我國東北重要的低溫森林生態系統優質用材樹種[1-2]，也是優良的綠色觀賞樹種和藥用植物。傳統的水曲柳繁殖是以種子繁殖為主，但其種子具有深休眠特性[3-4],給育苗生產帶來了一定的困難。水曲柳的嫁接和扦插等繁殖技術受到穗條數量少、位置效應[5-6]和采枝母樹的年齡效應[7]的影響，限制了規模化應用[8-9]。鑒于組織培養方法具有促進植株繁殖速度[10]、保持其優良性狀的特點，本試驗通過對水曲柳進行復幼處理，既成功獲得大量幼嫩穗條，解決了生產中穗條或插條來源少的問題，同時，其帶有頂芽或腋芽的莖節又可以作為組織培養的材料，解決了水曲柳組織培養主要依賴合子胚，以及誘導體細胞胚發生效率低的問題[11-13]，現將有關研究結果報道如下。

1　試驗材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為黑龍江省伊春市帶嶺區國家種子園栽培的2年生水曲柳實生苗。

1.2試驗方法

1.2.1水曲柳幼苗的復幼處理

為篩選出最佳復幼處理方式，本試驗于2014年4月10日將收集的實生苗定植于塑料花盆中，適應生長至5月1日，采用截干（地上部分留取10cm）、基部掩埋鋸末、噴施外源激素3種不同組合方式進行復幼處理，并以未采取任何處理的幼苗為對照（表1），每種處理8株幼苗，3次重復。

表1　實生苗的復幼處理方式

6月10日對截干處理方式的苗木進行第一次截干處理，并采集穗條，統計穗條數量、長度、直徑、莖節外植體數。之后，又分別于7月30日和9月10日進行兩次截干處理，采集所有穗條，統計相關數據。此后，因天氣原因，幼苗不再產生穗條。故本次試驗一年之內共采集3次穗條。

對于未進行截干處理的4種處理方式的幼苗于同一時間分別統計其當年生長枝條的生長量、直徑及其莖節外植體數。

1.2.2不同莖節外植體的初代培養

以萌條上帶頂芽或腋芽的莖節作為外植體，在接種前用流動水沖洗30min，無菌水沖洗3～4遍，再用75%酒精浸泡30 s，邊泡邊搖，然后用0.1%升汞滅菌2 min，用無菌水沖洗3～4遍。之后，將不同處理方式獲得的外植體隨機分為3組，分別接種到含BA 1.0 mg/L的WPM培養基中進行初代培養，促進啟動萌發，并統計不同處理的啟動率與增殖系數。

1.2.3不同激素組合的分化培養

本研究通過實證問卷調查，證實了經濟狀況在社會隔離與生存質量之間的調節作用，并基于社會資本理論視角，探討了三者關系的作用機制，以期為改善農村居民社會隔離現狀提供理論參考，并為提高農村居民生存質量貢獻切實策略。農村居民的社會隔離是社會變遷帶來的客觀結局，將極大地威脅到農村居民的生存質量。政府應當給予農村居民適當的政策關懷，豐富農村社交娛樂活動，鼓勵農村居民積極參與，增進人際互動關系，避免陷入社會隔離。此外，針對貧困地區居民應采取有效的幫扶政策，盡量避免農村居民承擔過重的經濟負荷，堅持共享改革發展成果，呵護農村居民的身心健康，著力增進農村居民福祉，進而早日實現人人健康，全面小康的總目標。

在經過一次繼代培養之后，組培苗出現不同程度的老化或休眠狀態，為此，本試驗將第一次繼代培養的組培苗平均分組繼代到4種含有不同激素組合的WPM培養基（表2）中，培養1個月后，統計各組培苗基部萌生芽數、芽生長量、萌生芽節間數、增殖系數。

為了綜合評價不同分化培養基中組培苗的分化效果，采用隸屬函數法，利用萌生芽數、芽生長量、萌生芽節間數、增殖系數4個指標的隸屬函數值對莖節萌生組培苗的分化能力進行了比較，以篩選出有利于組培苗分化的最佳培養基。隸屬函數計算公式為[14]

式中，Xij為i種培養基中組培苗j指標的測定值；Ximin為所有培養基中組培苗j指標測定值的最小值；Ximax為所有培養基中組培苗j指標測定值的最大值；為i培養基中組培苗j指標的隸屬函數值。

將各培養基所有指標的隸屬函數值進行累加，求其平均數得各培養基的隸屬函數值值大表示分化系數大，易于組培苗分化。

表2　3種培養基的激素組合

1.2.4數據統計

試驗數據采用IBMSPSS Statistics19.0進行方差分析，Dun-can檢測方法，0.05檢測水平。

2　結果與分析

2.1復幼處理對萌生枝條質量的影響

表3　不同時期各處理方式穗條質量

由各處理平均每株幼苗1年獲得的帶頂芽或腋芽的莖節外植體數（圖1）可以看出，4號處理（截干+噴施BA）與7號處理（僅截干）獲得的莖節外植體數顯著高于其它處理，其中4號處理獲得的莖節外植體數最高，平均值為20.22個，而對照僅為4.75個。

圖1　不同處理每株幼苗年產外植體數

試驗過程中，由于未經截干處理的水曲柳只有當年生長量而未萌生幼嫩穗條，而且用其當年生長枝條的莖節進行組織培養時不僅難以啟動，且較易染菌，故后繼的組培試驗中僅選取了經過截干處理的幼苗及對照組。

2.2不同莖節外植體的初代培養

2.2.1不同處理莖節外植體的啟動率

由接種到含BA 1.0 mg/L的WPM培養基中外植體所獲得的莖節萌發啟動率（圖2）可知：對照組的啟動率僅為36%，而處理1、4、5、7的啟動率分別為77%、80%、80%、78%，分別超過對照組115%、132%、132%、117%。這說明，水曲柳經復幼處理后，以其莖節外植體作為組織培養的材料，其萌發啟動效果要遠遠優于對照。

圖2　不同處理方式的外植體啟動率

2.2.2不同處理莖節外植體的初代培養效果

由不同莖節外植體初代培養時基部萌生芽數及增殖系數（圖3）可知，復幼處理的莖節外植體基部萌生芽數及增殖系數均高于對照，其中基部萌生芽數差異不顯著；1號處理（截干+噴施BA+掩埋鋸末）基部萌芽數最多，平均值為1.45個；對照組為1.22個。初代培養增殖系數差異顯著，1號處理增殖系數最高，為2.18；對照組為1.32。

圖3　不同處理方式莖節外植體初代培養效果

2.3不同激素組合的分化培養效果

由分化培養的基部萌生芽數、芽生長量、萌生芽節間數、增殖系數（圖4）可以看出，各試驗組合均有不同程度的組培苗分化，萌生芽數和生長量在4種培養基之間差異不顯著；4號培養基節間數顯著高于其它三種培養基；4號培養基增殖系數最高，為9.61，而3號培養基增殖系數最低，為6.67。說明在ZT濃度為1.0 mg/L的WPM培養基中培養莖節外植體有利于誘導組培苗的分化。

圖4　不同激素組合培養基的組培苗分化情況

利用萌生芽數、生長量、節間數、增殖系數4個指標的隸屬函數值對莖段萌生組培苗的分化能力進行綜合性評價的結果（表4）表明，組培苗分化能力最強的是4號培養基，其次為1號培養基，而3號培養基分化能力最弱。由此可以進一步說明，在ZT濃度為1.0 mg/L的WPM培養基中培養莖段外植體有利于誘導組培苗的分化。

表4　不同激素組合培養基組培苗分化能力綜合評價

3　討　論

3.1以莖節作為外植體進行組織培養受到穗條生長狀態的影響，越是幼嫩的穗條越有利于水曲柳的無性繁殖。本試驗通過復幼處理獲得了較對照組呈幼化狀態的穗條，這種穗條有利于扦插或嫁接。同時，由穗條獲得的莖節外植體不僅利于組織培養過程中的脫菌及萌芽處理，而且具有超出對照組1倍以上的啟動率，組培苗增殖系數顯著高于對照組。說明復幼處理不僅有利于維持穗條及外植體的幼化狀態，而且有利于水曲柳的微體繁殖。另外，為了解決以水曲柳穗條莖節作為外植體進行組織培養易出現老化現象[15]，本研究對培養條件進行了優化。

3.2對水曲柳實生苗進行復幼處理獲得的穗條具有較母樹更好的幼化效果，這與劉東玉[16]等對滇楊的研究結果一致。翁海龍[17]等利用建立采穗圃進行嫁接的方法獲得了良好的落葉松繼代嫁接幼化效果。毛竹[18]、玉米[19]等的相關研究表明，植株的成熟效應與基因組相關基因的甲基化狀態相關，可以進一步測定基因甲基化狀態來驗證復幼處理的幼化效果。

3.3微體繁殖是一種能夠保持優良品種遺傳性狀的快速繁殖方法，在微體繁殖過程中，各種植物生長調節劑能夠影響組培苗的生長量和分化狀態等指標[18]。本試驗在前期工作的基礎上采用4種不同激素組合的培養基進行了組培苗的分化培養，并篩選出較利于組培苗分化的培養基。

參考文獻

［1］Mee-Sook kiml.Carol M.Schumann.Ned B.Klopfenstein.Effects of thidiazuron and benzyladenine on axillary shoot proliferation of three green ash (Fraxinus pennsylvanica Marsh.) clones［J］.Plant Cell,Tissue and Organ Culture,1997(48):45-52.

［2］張桂芹，朱曉峰，于樹成，等.水曲柳種子園半同胞子代遺傳測定及優良家系選擇［J］.林業科技，2014,39(4):5-9.

［3］沈海龍，趙霞，邢朝斌.水曲柳扦插繁殖影響因子分析［J］.東北林業大學學報，2005(3):5-6.

［4］陸愛君.我國水曲柳育苗技術研究進展［J］.遼寧林業科技，2015(3):43-45 + 76.

［5］D.R.BHARDWAJ.V.K.MISHRA.Vegetative propagation of Ulmus villosa:effects of plant growth regulators,collection time,type of donor and position of shoot on adventitious root formation in stem cuttings［J］.New Forest,2005(29):105-116.DOI:10.1007/ s11056-005-0240-1.

［6］黃石竹，張彥東，王政權，等.水曲柳前4級細根N內循環的研究［J］.森林工程，2014,30(4):9-11.

［7］Jessica Snedden.Simion M.Landhausser.Victor J.Liffers.Lee R.Charleson.Propagating trembling aspen from root cutting:impact of storage length and phonological period of root donor plants［J］.New forests,2010(39):168-182.DOI:10.1007/s11056-009-9162-7.

［8］Mei L.Jiacun Gu.Zhuowen Zhang.Zhengquan Wang.Responses of fine root mass,length,production and turnover to soil nitrogen fertilization in Larix gmelinii and Fraxinus mandshurica forests inNortheastern China［J］.J For Res,2010(15):194-201.DOI:10.1007/s10310-009-0176-y.

［9］孫紅陽.水曲柳種子的萌發與次生休眠解除過程中物質轉化的研究［D］.哈爾濱：東北林業大學，2007.

［10］張鵬.不同發育階段水曲柳種子的休眠與萌發生理［D］.哈爾濱：東北林業大學，2008.

［11］張惠君.水曲柳未成熟胚的離體培養研究［J］.林業科學，2003(3):63-69 + 177.

［12］孔冬梅.水曲柳體細胞胚與合子胚發生的細胞學研究［J］.林業科學，2006(12):130-133 + 177.

［13］Dong-Mei Kong.Hai-Lony Shen.Somatic embryogenesis in immature cotyledons of Manchurian ash (Fraxinus mandshurica Rupr)［J］.Plant Cell Tiss Organ Cult,2012(108):485-492.DOI:10.1007/s 11240-011-0062-0.

［14］王來平.山東主栽矮化中間砧蘋果抗旱性主成分及隸屬函數分析［J］.中國農學通報，2015（10）：107-111.

［15］Ling Yang Lei Bian .Hai-long Shen.Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from mature zygotic embryos of Manchurian ash (Fraxinus mandshurica Rupr)［J］.Plant Cell Tiss Organ Cult,2013(115):115-125 .DOI 10.1007/s11240-013-0345-8.

［16］劉東玉，周安佩.不同處理措施對滇楊根萌苗形成與生長的影響［J］.西南林業大學學報，2014（1）：31-35 + 39.

［17］翁海龍.雜種落葉松繼代嫁接幼化技術研究初報［J］.林業科技，2015（1）：22-23 + 58.

［18］郭廣平.竹類植物生長發育過程中的DN甲基化研究［D］.中國林業科學研究院，2011.

［19］Erin E.Irish.Douglas McMurray.Rejuvenation by shoot apex culture recapitulates the developmental increase of methylation at the maize gene Pl-Blotched［J］.Plant Molecular Biology,2006 (60):747-758.DOI 10.1007/s11103-005-5620-6.

［20］Teresa Martinez.Nieves Vidal.Antonio Ballester.Ana M.Vietez.Improved organogenic capacity of shoot cultures from mature pedunculate oak trees through somatic embryogenesis as rejuvenation technique［J］.Trees,2012(26):321-330.

（責任編輯：王岳）

Rejuvenation and Micropropagation Study in Fraxinus mandschurica

XUE Wenhui
（College of Life Science,Northeast Forestry University,Heilongjiang Harbin 150040）

Abstract 2 years old seedlings of Fraxinus mandschurica were treated by cutting,spraying hormones and covering with sawdust.In order to explore the influence of different treatments on the seedlings,the apical and lateral buds that germinated from the treated shoots were cultured in the same medium.And then the culture condition of tissue culture seedlings was optimized by using the same medium with different hormones combinations.The results showed that:(1) the number,length and diameter of coppice shoot that came from young seedlings and treated by cutting and hormones,were better than other treatments.Under this treatment,one seedling could produce six to seven coppice shoots for grafting or about twenty stems for tissue culturing every year.(2) The average germinate rate of explants and the propagation coefficient of the tissue culture seedlings were higher than the untreated seedlings.The germinate rate of the explants which came from cutted and sprayed seedlings was 232% of CK.But the propagation coefficient of the tissue culture seedlings which came from seedlings treated with three treatments was 165% of CK.(3)As to the attaching functional value，the tissue culture seedlings from four different medium were evaluated,the WPM medium with 2% sugar and 1.0mg/L ZT were best for seedlings propagation.The propagation coefficient was as high as 9.61,which reached significant level comparing with other treatments.

Key words Fraxinus mandschurica; Sprout promoting; Rejuvenation; Micropropagation

收稿日期：2016-01-12

通訊作者：詹亞光（1963-），女，教授，博士生導師，博士，主要研究方向：植物生物技術。

作者簡介：第1薛文輝（1987-），男，主要研究方向為植物生物技術。

文章編號：1001-9499（2016）02-0004-05

中圖分類號：S792.41,S722.8

文獻標識碼：A