血脂相關影響N素與廣西壯族人群泌尿系結石關系研究

吳計超　黃群　孟冬冬　黃敏玉　潘思穎

[摘要]目的 探討血脂相關影響因素與廣西壯族泌尿系結石的相關性。方法 分別選取來院就診的120例壯族泌尿系結石患者與120例壯族體檢正常者列為結石組和對照組，采集兩組受檢者空腹靜脈血液3～5 ml，分離血清后采用日立7600全自動生化分析儀進行總膽固醇（Tc）、血三酰甘油（TG）、血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和血漿載脂蛋白A、B、E（ApoA、ApoB、ApoE）測定。分析兩組人群血脂相關因素及家族史差異.并用PCR-測序技術檢測兩組人群的ApoE基因序列。結果 兩組人群TG、TC、HDL-C和血漿ApoE比較差異有統計學意義（P<0.001），結石組TG、TC和血漿ApoE水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組。結石組有家族史33人，占27.5%（33/120），對照組有家族史14人，占11.7%（14/120），兩組比較差異有統計學意義（x2=9.551，P=0.002，OR=2.87，95%CI：1.45-5.71）。兩組人群ApoE基因的三個外顯子序列對比無突變。結論 在廣西壯族人群中，高Tc、TG、ApoE水平及低HDL-C水平與泌尿系結石形成相關，有結石家族史的人群更易患泌尿系結石，但ApoE基因第1、2、3外顯子上未發現與泌尿系結石相關的基因突變。

[關鍵詞]血脂；泌尿系結石；基因

泌尿系結石是泌尿外科最常見的疾病，在廣西壯族人群中發病率較高。泌尿系結石成因復雜，與很多因素均有關系，如遺傳、解剖、環境、性別、代謝等。其中血脂異常與泌尿系結石的關系在過去未受重視.但近年來越來越多的研究結果表明血脂異常與泌尿系結石發病密切相關。在遺傳研究方面，腎結石雙生子對照研究揭示了其遺傳度為52%-56%，反映了遺傳在泌尿系結石形成中的重要作用。本研究探討了血脂水平對廣西壯族人群泌尿系結石的影響，并研究了部分遺傳病因。

1.資料與方法

1.1一般資料 結石組的納入標準：（1）經x射線、B超、CT等影像學檢查確診泌尿系結石；（2）父母皆為壯族，且居住本地10年以上。排除標準：（1）患有尿路畸形、尿路感染等泌尿系統疾病；（2）胃、腸等消化道功能疾病患者；（3）存在腎衰、腎功能不全等癥。共選人120例泌尿系結石患者參與本次研究，男性83例.女性37例；年齡11-73歲，平均（41.0_+10.5）歲。其中上尿路結石82例，占68.3%；下尿路結石17例，占14.2%；復合型結石21例，占17.5%。同時選取同期體檢正常且無泌尿系結石病史的120名正常者，納人對照組。對照組男性79例，女性41例；年齡10-70歲，平均（39.0±10.6）歲。對照組的選擇也均為壯族人群，并保證了兩組人群在年齡、性別方面差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2實驗儀器 Hitachi7600型全自動生化分析儀（日立，日本），Verity 96well PCR儀、Gene Genius凝膠成像儀（syngene，英國），3730XL測序儀（ABI，美國），HC-2518R冷凍離心機（BBI，加拿大），TGL-14G臺式高速離心機（上海醫療器械有限公司），DYY-8C電泳儀（北京六一儀器廠），H6-1電泳槽（上海精益有機玻璃制品儀器廠），XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），HS-800D數顯恒溫水浴鍋（蕪湖金瑞特計量檢測儀器有限公司），SW-CJ-1D潔凈工作臺（江蘇蘇潔凈化設備廠），100-1000 ml、20-200 ml、0.5-10 ml、0.1-0.25 ml移液器（BBI公司，加拿大）。

1.3實驗試劑 引物、Pfu DNA Polymerase高溫聚合酶、MgCl，（25 mM）、10×PCR Buffer、dNTP（10mM）、6×DNA Loading Dye、DNA marker、10×TAE、PCR產物純化回收試劑盒、無乙水醇、異丙醇、丙三醇、DNA提取試劑盒。

1.4檢查及分析方法

1.4.1血脂檢查 采集受檢者空腹靜脈血液3-5 ml，分離血清后采用日立7600全自動生化分析儀進行總膽固醇（TC）、血三酰甘油（TG）、血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和血漿載脂蛋白A、B、E（ApoA、ApoB、ApoE）測定。

1.4.2DNA提取 將分離所剩血液按DNA提取試劑盒操作.提取出的DNA經紫外分光光度計檢測濃度與純度，達到標準后放置200C冰箱保存。

1.4.3PCR擴增及基因測序 ApoE三個外顯子引物分別為：1F 5-CTCTATGCCCCACCTCCTF-3：1R5-CCCCGAGTAGCTCTCCTGA-3：2F 5-AACAAG-GCTFGGAAGGCTA-3：2R 5-CAGCACAGAAGCCT-CAGAAGA-3；3F 5-CTCACCCTGCCCACCAT-3；3R 5-CAGGCCCCCCAAGACTT-3。PCR反應體系為：1 uL模板，0.5 uL引物F，0.5 uL引物R，0.5 uLdNTP 10 mM，2.5 uL Taq Buffer，0.2 uL Taq酶（5 U/IxL），20 uL水。PCR反應條件為：95～C預變性3min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s至60 s，經35個循環后在72℃下延伸10 min。所得產物經1.5%TAE瓊脂糖電泳，以確定PCR擴增是否有效，電泳條件為150 V、100 mA 20 min。PCR產物純化回收試劑盒，于測序儀上完成測序（此步驟由上海生工生物工程股份有限公司完成）。

1.5統計學方法 使用SPSS 17.0進行數據處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組均數比較采用兩獨立樣本t檢驗.計數資料用百分率表示，組間比較采用x2檢驗，檢驗水準：a=0.05，雙側檢驗。

2.結果

2.1兩組血脂及相關指標的比較 兩組人群TG、TC、HDL-C和血漿ApoE比較差異有統計學意義（P<0.001），結石組TG、TC和血漿ApoE水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組。見表1。

2.2兩組人群家族史對比 結石組有家族史33人，占27.5%（33/120），對照組有家族史14人，占11.7%（14/120），兩組比較差異有統計學意義（x2=9.551，P=0.002，OR=2.87，95%CI：1.45-5.71）。即結石組相較于對照組，其家族中一級親屬患泌尿系結石的風險更高.有家族史人群比沒有家族史人群更易患泌尿系結石。

2.3兩組人群ApoE基因對比 對240個樣本ApoE基因的三個外顯子進行PCR后測序，結果顯示，結石組和對照組的堿基序列均無突變。將所得序列與NCBI公布的ApoE序列對比.并未發現差異。PCR后電泳結果見圖1，測序結果見圖2。

3.討論

泌尿系結石的發病率與復發率均較高，給患者增加經濟負擔的同時，也讓患者承受了極大的痛苦，因此，明確其病因尤為重要。尿路結石病因復雜，可能涉及代謝、解剖、感染、環境、社會、遺傳、飲食等多個方面。其中，血脂代謝與泌尿系結石的相關性研究已取得一定的進展.但研究結果并不完全一致。國外Masterson等通過泌尿系結石患者大樣本回訪研究，認為血脂譜中高TG、LDL-C水平與泌尿系結石的發生不相關，僅HDL-C水平降低與之有關。國內柴東岳等通過結石組與對照組為1：2配比的對照研究，認為高TC、TG、LDL-C、低HDL-C水平與泌尿系結石顯著相關，并且低HDL-C血癥和高LDL-C血癥是上尿路結石患者發病的獨立危險因素。因此本研究在廣西壯族人群中進行血脂與泌尿系結石的相關性研究，并加入了載脂蛋白的因素，結果顯示，高TC、TG、ApoE水平及低HDL-C水平與泌尿系結石的產生相關，而LDL-C、ApoA、ApoB水平與泌尿系結石不相關。

幾乎所有研究均確認了低HDL水平與泌尿系結石的關系。低HDL-C引起泌尿系結石的原因，可能是結石患者存在逆向轉運膽固醇功能障礙.導致流人肝臟的游離脂肪酸減少，流人腎臟等肝外器官的游離脂肪酸增加.然后從以下幾個方面導致結石形成：血脂升高產生的氧化應激，導致腎小管上皮細胞的損害成為尿路結石形成的起始環節：脂類排泄增多參與結石形成，其中糖脂是結石的主要脂類：腎小管的脂肪浸潤引起Na+/H+交換體（NHE3）減少，尿液酸化，從而誘發草酸鈣、尿酸鹽結晶的形成。此外，也有研究者認為，進入腎臟的游離脂肪酸增加會引起NADP-NADPH介導的5-磷酸核糖向磷酸核糖焦磷酸的嘌呤從頭合成亢進，引起尿酸生成增加，并且TG降解生成的部分游離脂肪酸再酯化進人其他組織的過程，也會使尿酸生成增加。本次實驗中關于TC和LDL-C的結果與部分文獻報道不同.可能的原因是決定腎臟脂肪浸潤的關鍵因素在于HDL-C水平，而TC、HDL-C受飲食及肝代謝的影響較大，此外，環境、生活習慣、民族差異也可能對結果存在影響。

載脂蛋白E是一種重要膽固醇載體，在體內起到運輸脂類及膽固醇的作用。本實驗發現結石組中載脂蛋白E和TC的水平要高于對照組，差異有統計學意義，提示進入腎臟的膽固醇增多與結石的形成有關。有研究提示膽固醇具有促進結石成核作用，并且膽固醇在血管和內皮下沉積過多，會致使濾過膜屏障損壞，其具體的分子生物學機制，有待進一步研究證實。

本實驗顯示，泌尿系結石患者家族中一級親屬患泌尿系結石的風險更高，有家族史人群比沒有家族史人群更易患泌尿系結石，說明了遺傳在結石發病中的重要作用。近年已發現很多基因與泌尿系結石存在關系，其中研究較多的是OPN基因、Klotho基因和VDR基因，而關于載脂蛋白E與泌尿系結石的關系研究較少。載脂蛋白E與血脂代謝的關系毋庸置疑，血脂異常又與泌尿系結石關系緊密，故我們推測載脂蛋白E的基因多態性與泌尿系結石存在一定的關系。Qian等在維吾爾族人群中發現載脂蛋白E的E3/4和E4分別為泌尿系結石患者的易感基因型和易感等位基因。但是本次實驗在廣西壯族人群中未發現與泌尿系結石相關的ApoE基因突變點，這似與Qian等的結論存在差異。有兩種可能，其一E4突變點可能位于第四外顯子和非編碼序列上；其二，這種差異可能為種族和地域差異所致。

綜上所述.血甘油三酯、總膽固醇與廣西壯族人群泌尿系結石的產生存在一定的關系.是否可以通過控制上述臨床指標促進結石的清除、降低復發的風險，有待下一步大樣本臨床研究和基礎機制研究。基因篩查對一些復發性結石確有一定診斷意義，并根據病因合理指導治療。但我們并未在載脂蛋白E基因的前三個外顯子上發現如Qian所報道的基因突變，對于基因篩查指標的選擇仍需要大量的實驗研究。

吳計超　黃群　孟冬冬　黃敏玉　潘思穎

[摘要]目的 探討血脂相關影響因素與廣西壯族泌尿系結石的相關性。方法 分別選取來院就診的120例壯族泌尿系結石患者與120例壯族體檢正常者列為結石組和對照組，采集兩組受檢者空腹靜脈血液3～5 ml，分離血清后采用日立7600全自動生化分析儀進行總膽固醇（Tc）、血三酰甘油（TG）、血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和血漿載脂蛋白A、B、E（ApoA、ApoB、ApoE）測定。分析兩組人群血脂相關因素及家族史差異.并用PCR-測序技術檢測兩組人群的ApoE基因序列。結果 兩組人群TG、TC、HDL-C和血漿ApoE比較差異有統計學意義（P<0.001），結石組TG、TC和血漿ApoE水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組。結石組有家族史33人，占27.5%（33/120），對照組有家族史14人，占11.7%（14/120），兩組比較差異有統計學意義（x2=9.551，P=0.002，OR=2.87，95%CI：1.45-5.71）。兩組人群ApoE基因的三個外顯子序列對比無突變。結論 在廣西壯族人群中，高Tc、TG、ApoE水平及低HDL-C水平與泌尿系結石形成相關，有結石家族史的人群更易患泌尿系結石，但ApoE基因第1、2、3外顯子上未發現與泌尿系結石相關的基因突變。

[關鍵詞]血脂；泌尿系結石；基因

泌尿系結石是泌尿外科最常見的疾病，在廣西壯族人群中發病率較高。泌尿系結石成因復雜，與很多因素均有關系，如遺傳、解剖、環境、性別、代謝等。其中血脂異常與泌尿系結石的關系在過去未受重視.但近年來越來越多的研究結果表明血脂異常與泌尿系結石發病密切相關。在遺傳研究方面，腎結石雙生子對照研究揭示了其遺傳度為52%-56%，反映了遺傳在泌尿系結石形成中的重要作用。本研究探討了血脂水平對廣西壯族人群泌尿系結石的影響，并研究了部分遺傳病因。

1.資料與方法

1.1一般資料 結石組的納入標準：（1）經x射線、B超、CT等影像學檢查確診泌尿系結石；（2）父母皆為壯族，且居住本地10年以上。排除標準：（1）患有尿路畸形、尿路感染等泌尿系統疾病；（2）胃、腸等消化道功能疾病患者；（3）存在腎衰、腎功能不全等癥。共選人120例泌尿系結石患者參與本次研究，男性83例.女性37例；年齡11-73歲，平均（41.0_+10.5）歲。其中上尿路結石82例，占68.3%；下尿路結石17例，占14.2%；復合型結石21例，占17.5%。同時選取同期體檢正常且無泌尿系結石病史的120名正常者，納人對照組。對照組男性79例，女性41例；年齡10-70歲，平均（39.0±10.6）歲。對照組的選擇也均為壯族人群，并保證了兩組人群在年齡、性別方面差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2實驗儀器 Hitachi7600型全自動生化分析儀（日立，日本），Verity 96well PCR儀、Gene Genius凝膠成像儀（syngene，英國），3730XL測序儀（ABI，美國），HC-2518R冷凍離心機（BBI，加拿大），TGL-14G臺式高速離心機（上海醫療器械有限公司），DYY-8C電泳儀（北京六一儀器廠），H6-1電泳槽（上海精益有機玻璃制品儀器廠），XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），HS-800D數顯恒溫水浴鍋（蕪湖金瑞特計量檢測儀器有限公司），SW-CJ-1D潔凈工作臺（江蘇蘇潔凈化設備廠），100-1000 ml、20-200 ml、0.5-10 ml、0.1-0.25 ml移液器（BBI公司，加拿大）。

1.3實驗試劑 引物、Pfu DNA Polymerase高溫聚合酶、MgCl，（25 mM）、10×PCR Buffer、dNTP（10mM）、6×DNA Loading Dye、DNA marker、10×TAE、PCR產物純化回收試劑盒、無乙水醇、異丙醇、丙三醇、DNA提取試劑盒。

1.4檢查及分析方法

1.4.1血脂檢查 采集受檢者空腹靜脈血液3-5 ml，分離血清后采用日立7600全自動生化分析儀進行總膽固醇（TC）、血三酰甘油（TG）、血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和血漿載脂蛋白A、B、E（ApoA、ApoB、ApoE）測定。

1.4.2DNA提取 將分離所剩血液按DNA提取試劑盒操作.提取出的DNA經紫外分光光度計檢測濃度與純度，達到標準后放置200C冰箱保存。

1.4.3PCR擴增及基因測序 ApoE三個外顯子引物分別為：1F 5-CTCTATGCCCCACCTCCTF-3：1R5-CCCCGAGTAGCTCTCCTGA-3：2F 5-AACAAG-GCTFGGAAGGCTA-3：2R 5-CAGCACAGAAGCCT-CAGAAGA-3；3F 5-CTCACCCTGCCCACCAT-3；3R 5-CAGGCCCCCCAAGACTT-3。PCR反應體系為：1 uL模板，0.5 uL引物F，0.5 uL引物R，0.5 uLdNTP 10 mM，2.5 uL Taq Buffer，0.2 uL Taq酶（5 U/IxL），20 uL水。PCR反應條件為：95～C預變性3min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s至60 s，經35個循環后在72℃下延伸10 min。所得產物經1.5%TAE瓊脂糖電泳，以確定PCR擴增是否有效，電泳條件為150 V、100 mA 20 min。PCR產物純化回收試劑盒，于測序儀上完成測序（此步驟由上海生工生物工程股份有限公司完成）。

1.5統計學方法 使用SPSS 17.0進行數據處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組均數比較采用兩獨立樣本t檢驗.計數資料用百分率表示，組間比較采用x2檢驗，檢驗水準：a=0.05，雙側檢驗。

2.結果

2.1兩組血脂及相關指標的比較 兩組人群TG、TC、HDL-C和血漿ApoE比較差異有統計學意義（P<0.001），結石組TG、TC和血漿ApoE水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組。見表1。

2.2兩組人群家族史對比 結石組有家族史33人，占27.5%（33/120），對照組有家族史14人，占11.7%（14/120），兩組比較差異有統計學意義（x2=9.551，P=0.002，OR=2.87，95%CI：1.45-5.71）。即結石組相較于對照組，其家族中一級親屬患泌尿系結石的風險更高.有家族史人群比沒有家族史人群更易患泌尿系結石。

2.3兩組人群ApoE基因對比 對240個樣本ApoE基因的三個外顯子進行PCR后測序，結果顯示，結石組和對照組的堿基序列均無突變。將所得序列與NCBI公布的ApoE序列對比.并未發現差異。PCR后電泳結果見圖1，測序結果見圖2。

3.討論

泌尿系結石的發病率與復發率均較高，給患者增加經濟負擔的同時，也讓患者承受了極大的痛苦，因此，明確其病因尤為重要。尿路結石病因復雜，可能涉及代謝、解剖、感染、環境、社會、遺傳、飲食等多個方面。其中，血脂代謝與泌尿系結石的相關性研究已取得一定的進展.但研究結果并不完全一致。國外Masterson等通過泌尿系結石患者大樣本回訪研究，認為血脂譜中高TG、LDL-C水平與泌尿系結石的發生不相關，僅HDL-C水平降低與之有關。國內柴東岳等通過結石組與對照組為1：2配比的對照研究，認為高TC、TG、LDL-C、低HDL-C水平與泌尿系結石顯著相關，并且低HDL-C血癥和高LDL-C血癥是上尿路結石患者發病的獨立危險因素。因此本研究在廣西壯族人群中進行血脂與泌尿系結石的相關性研究，并加入了載脂蛋白的因素，結果顯示，高TC、TG、ApoE水平及低HDL-C水平與泌尿系結石的產生相關，而LDL-C、ApoA、ApoB水平與泌尿系結石不相關。

幾乎所有研究均確認了低HDL水平與泌尿系結石的關系。低HDL-C引起泌尿系結石的原因，可能是結石患者存在逆向轉運膽固醇功能障礙.導致流人肝臟的游離脂肪酸減少，流人腎臟等肝外器官的游離脂肪酸增加.然后從以下幾個方面導致結石形成：血脂升高產生的氧化應激，導致腎小管上皮細胞的損害成為尿路結石形成的起始環節：脂類排泄增多參與結石形成，其中糖脂是結石的主要脂類：腎小管的脂肪浸潤引起Na+/H+交換體（NHE3）減少，尿液酸化，從而誘發草酸鈣、尿酸鹽結晶的形成。此外，也有研究者認為，進入腎臟的游離脂肪酸增加會引起NADP-NADPH介導的5-磷酸核糖向磷酸核糖焦磷酸的嘌呤從頭合成亢進，引起尿酸生成增加，并且TG降解生成的部分游離脂肪酸再酯化進人其他組織的過程，也會使尿酸生成增加。本次實驗中關于TC和LDL-C的結果與部分文獻報道不同.可能的原因是決定腎臟脂肪浸潤的關鍵因素在于HDL-C水平，而TC、HDL-C受飲食及肝代謝的影響較大，此外，環境、生活習慣、民族差異也可能對結果存在影響。

載脂蛋白E是一種重要膽固醇載體，在體內起到運輸脂類及膽固醇的作用。本實驗發現結石組中載脂蛋白E和TC的水平要高于對照組，差異有統計學意義，提示進入腎臟的膽固醇增多與結石的形成有關。有研究提示膽固醇具有促進結石成核作用，并且膽固醇在血管和內皮下沉積過多，會致使濾過膜屏障損壞，其具體的分子生物學機制，有待進一步研究證實。

本實驗顯示，泌尿系結石患者家族中一級親屬患泌尿系結石的風險更高，有家族史人群比沒有家族史人群更易患泌尿系結石，說明了遺傳在結石發病中的重要作用。近年已發現很多基因與泌尿系結石存在關系，其中研究較多的是OPN基因、Klotho基因和VDR基因，而關于載脂蛋白E與泌尿系結石的關系研究較少。載脂蛋白E與血脂代謝的關系毋庸置疑，血脂異常又與泌尿系結石關系緊密，故我們推測載脂蛋白E的基因多態性與泌尿系結石存在一定的關系。Qian等在維吾爾族人群中發現載脂蛋白E的E3/4和E4分別為泌尿系結石患者的易感基因型和易感等位基因。但是本次實驗在廣西壯族人群中未發現與泌尿系結石相關的ApoE基因突變點，這似與Qian等的結論存在差異。有兩種可能，其一E4突變點可能位于第四外顯子和非編碼序列上；其二，這種差異可能為種族和地域差異所致。

綜上所述.血甘油三酯、總膽固醇與廣西壯族人群泌尿系結石的產生存在一定的關系.是否可以通過控制上述臨床指標促進結石的清除、降低復發的風險，有待下一步大樣本臨床研究和基礎機制研究。基因篩查對一些復發性結石確有一定診斷意義，并根據病因合理指導治療。但我們并未在載脂蛋白E基因的前三個外顯子上發現如Qian所報道的基因突變，對于基因篩查指標的選擇仍需要大量的實驗研究。

吳計超　黃群　孟冬冬　黃敏玉　潘思穎

[摘要]目的 探討血脂相關影響因素與廣西壯族泌尿系結石的相關性。方法 分別選取來院就診的120例壯族泌尿系結石患者與120例壯族體檢正常者列為結石組和對照組，采集兩組受檢者空腹靜脈血液3～5 ml，分離血清后采用日立7600全自動生化分析儀進行總膽固醇（Tc）、血三酰甘油（TG）、血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和血漿載脂蛋白A、B、E（ApoA、ApoB、ApoE）測定。分析兩組人群血脂相關因素及家族史差異.并用PCR-測序技術檢測兩組人群的ApoE基因序列。結果 兩組人群TG、TC、HDL-C和血漿ApoE比較差異有統計學意義（P<0.001），結石組TG、TC和血漿ApoE水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組。結石組有家族史33人，占27.5%（33/120），對照組有家族史14人，占11.7%（14/120），兩組比較差異有統計學意義（x2=9.551，P=0.002，OR=2.87，95%CI：1.45-5.71）。兩組人群ApoE基因的三個外顯子序列對比無突變。結論 在廣西壯族人群中，高Tc、TG、ApoE水平及低HDL-C水平與泌尿系結石形成相關，有結石家族史的人群更易患泌尿系結石，但ApoE基因第1、2、3外顯子上未發現與泌尿系結石相關的基因突變。

[關鍵詞]血脂；泌尿系結石；基因

泌尿系結石是泌尿外科最常見的疾病，在廣西壯族人群中發病率較高。泌尿系結石成因復雜，與很多因素均有關系，如遺傳、解剖、環境、性別、代謝等。其中血脂異常與泌尿系結石的關系在過去未受重視.但近年來越來越多的研究結果表明血脂異常與泌尿系結石發病密切相關。在遺傳研究方面，腎結石雙生子對照研究揭示了其遺傳度為52%-56%，反映了遺傳在泌尿系結石形成中的重要作用。本研究探討了血脂水平對廣西壯族人群泌尿系結石的影響，并研究了部分遺傳病因。

1.資料與方法

1.1一般資料 結石組的納入標準：（1）經x射線、B超、CT等影像學檢查確診泌尿系結石；（2）父母皆為壯族，且居住本地10年以上。排除標準：（1）患有尿路畸形、尿路感染等泌尿系統疾病；（2）胃、腸等消化道功能疾病患者；（3）存在腎衰、腎功能不全等癥。共選人120例泌尿系結石患者參與本次研究，男性83例.女性37例；年齡11-73歲，平均（41.0_+10.5）歲。其中上尿路結石82例，占68.3%；下尿路結石17例，占14.2%；復合型結石21例，占17.5%。同時選取同期體檢正常且無泌尿系結石病史的120名正常者，納人對照組。對照組男性79例，女性41例；年齡10-70歲，平均（39.0±10.6）歲。對照組的選擇也均為壯族人群，并保證了兩組人群在年齡、性別方面差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2實驗儀器 Hitachi7600型全自動生化分析儀（日立，日本），Verity 96well PCR儀、Gene Genius凝膠成像儀（syngene，英國），3730XL測序儀（ABI，美國），HC-2518R冷凍離心機（BBI，加拿大），TGL-14G臺式高速離心機（上海醫療器械有限公司），DYY-8C電泳儀（北京六一儀器廠），H6-1電泳槽（上海精益有機玻璃制品儀器廠），XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），HS-800D數顯恒溫水浴鍋（蕪湖金瑞特計量檢測儀器有限公司），SW-CJ-1D潔凈工作臺（江蘇蘇潔凈化設備廠），100-1000 ml、20-200 ml、0.5-10 ml、0.1-0.25 ml移液器（BBI公司，加拿大）。

1.3實驗試劑 引物、Pfu DNA Polymerase高溫聚合酶、MgCl，（25 mM）、10×PCR Buffer、dNTP（10mM）、6×DNA Loading Dye、DNA marker、10×TAE、PCR產物純化回收試劑盒、無乙水醇、異丙醇、丙三醇、DNA提取試劑盒。

1.4檢查及分析方法

1.4.1血脂檢查 采集受檢者空腹靜脈血液3-5 ml，分離血清后采用日立7600全自動生化分析儀進行總膽固醇（TC）、血三酰甘油（TG）、血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和血漿載脂蛋白A、B、E（ApoA、ApoB、ApoE）測定。

1.4.2DNA提取 將分離所剩血液按DNA提取試劑盒操作.提取出的DNA經紫外分光光度計檢測濃度與純度，達到標準后放置200C冰箱保存。

1.4.3PCR擴增及基因測序 ApoE三個外顯子引物分別為：1F 5-CTCTATGCCCCACCTCCTF-3：1R5-CCCCGAGTAGCTCTCCTGA-3：2F 5-AACAAG-GCTFGGAAGGCTA-3：2R 5-CAGCACAGAAGCCT-CAGAAGA-3；3F 5-CTCACCCTGCCCACCAT-3；3R 5-CAGGCCCCCCAAGACTT-3。PCR反應體系為：1 uL模板，0.5 uL引物F，0.5 uL引物R，0.5 uLdNTP 10 mM，2.5 uL Taq Buffer，0.2 uL Taq酶（5 U/IxL），20 uL水。PCR反應條件為：95～C預變性3min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s至60 s，經35個循環后在72℃下延伸10 min。所得產物經1.5%TAE瓊脂糖電泳，以確定PCR擴增是否有效，電泳條件為150 V、100 mA 20 min。PCR產物純化回收試劑盒，于測序儀上完成測序（此步驟由上海生工生物工程股份有限公司完成）。

1.5統計學方法 使用SPSS 17.0進行數據處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組均數比較采用兩獨立樣本t檢驗.計數資料用百分率表示，組間比較采用x2檢驗，檢驗水準：a=0.05，雙側檢驗。

2.結果

2.1兩組血脂及相關指標的比較 兩組人群TG、TC、HDL-C和血漿ApoE比較差異有統計學意義（P<0.001），結石組TG、TC和血漿ApoE水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組。見表1。

2.2兩組人群家族史對比 結石組有家族史33人，占27.5%（33/120），對照組有家族史14人，占11.7%（14/120），兩組比較差異有統計學意義（x2=9.551，P=0.002，OR=2.87，95%CI：1.45-5.71）。即結石組相較于對照組，其家族中一級親屬患泌尿系結石的風險更高.有家族史人群比沒有家族史人群更易患泌尿系結石。

2.3兩組人群ApoE基因對比 對240個樣本ApoE基因的三個外顯子進行PCR后測序，結果顯示，結石組和對照組的堿基序列均無突變。將所得序列與NCBI公布的ApoE序列對比.并未發現差異。PCR后電泳結果見圖1，測序結果見圖2。

3.討論

泌尿系結石的發病率與復發率均較高，給患者增加經濟負擔的同時，也讓患者承受了極大的痛苦，因此，明確其病因尤為重要。尿路結石病因復雜，可能涉及代謝、解剖、感染、環境、社會、遺傳、飲食等多個方面。其中，血脂代謝與泌尿系結石的相關性研究已取得一定的進展.但研究結果并不完全一致。國外Masterson等通過泌尿系結石患者大樣本回訪研究，認為血脂譜中高TG、LDL-C水平與泌尿系結石的發生不相關，僅HDL-C水平降低與之有關。國內柴東岳等通過結石組與對照組為1：2配比的對照研究，認為高TC、TG、LDL-C、低HDL-C水平與泌尿系結石顯著相關，并且低HDL-C血癥和高LDL-C血癥是上尿路結石患者發病的獨立危險因素。因此本研究在廣西壯族人群中進行血脂與泌尿系結石的相關性研究，并加入了載脂蛋白的因素，結果顯示，高TC、TG、ApoE水平及低HDL-C水平與泌尿系結石的產生相關，而LDL-C、ApoA、ApoB水平與泌尿系結石不相關。

幾乎所有研究均確認了低HDL水平與泌尿系結石的關系。低HDL-C引起泌尿系結石的原因，可能是結石患者存在逆向轉運膽固醇功能障礙.導致流人肝臟的游離脂肪酸減少，流人腎臟等肝外器官的游離脂肪酸增加.然后從以下幾個方面導致結石形成：血脂升高產生的氧化應激，導致腎小管上皮細胞的損害成為尿路結石形成的起始環節：脂類排泄增多參與結石形成，其中糖脂是結石的主要脂類：腎小管的脂肪浸潤引起Na+/H+交換體（NHE3）減少，尿液酸化，從而誘發草酸鈣、尿酸鹽結晶的形成。此外，也有研究者認為，進入腎臟的游離脂肪酸增加會引起NADP-NADPH介導的5-磷酸核糖向磷酸核糖焦磷酸的嘌呤從頭合成亢進，引起尿酸生成增加，并且TG降解生成的部分游離脂肪酸再酯化進人其他組織的過程，也會使尿酸生成增加。本次實驗中關于TC和LDL-C的結果與部分文獻報道不同.可能的原因是決定腎臟脂肪浸潤的關鍵因素在于HDL-C水平，而TC、HDL-C受飲食及肝代謝的影響較大，此外，環境、生活習慣、民族差異也可能對結果存在影響。

載脂蛋白E是一種重要膽固醇載體，在體內起到運輸脂類及膽固醇的作用。本實驗發現結石組中載脂蛋白E和TC的水平要高于對照組，差異有統計學意義，提示進入腎臟的膽固醇增多與結石的形成有關。有研究提示膽固醇具有促進結石成核作用，并且膽固醇在血管和內皮下沉積過多，會致使濾過膜屏障損壞，其具體的分子生物學機制，有待進一步研究證實。

本實驗顯示，泌尿系結石患者家族中一級親屬患泌尿系結石的風險更高，有家族史人群比沒有家族史人群更易患泌尿系結石，說明了遺傳在結石發病中的重要作用。近年已發現很多基因與泌尿系結石存在關系，其中研究較多的是OPN基因、Klotho基因和VDR基因，而關于載脂蛋白E與泌尿系結石的關系研究較少。載脂蛋白E與血脂代謝的關系毋庸置疑，血脂異常又與泌尿系結石關系緊密，故我們推測載脂蛋白E的基因多態性與泌尿系結石存在一定的關系。Qian等在維吾爾族人群中發現載脂蛋白E的E3/4和E4分別為泌尿系結石患者的易感基因型和易感等位基因。但是本次實驗在廣西壯族人群中未發現與泌尿系結石相關的ApoE基因突變點，這似與Qian等的結論存在差異。有兩種可能，其一E4突變點可能位于第四外顯子和非編碼序列上；其二，這種差異可能為種族和地域差異所致。

綜上所述.血甘油三酯、總膽固醇與廣西壯族人群泌尿系結石的產生存在一定的關系.是否可以通過控制上述臨床指標促進結石的清除、降低復發的風險，有待下一步大樣本臨床研究和基礎機制研究。基因篩查對一些復發性結石確有一定診斷意義，并根據病因合理指導治療。但我們并未在載脂蛋白E基因的前三個外顯子上發現如Qian所報道的基因突變，對于基因篩查指標的選擇仍需要大量的實驗研究。