苦瓜總皂苷對2型糖尿病腎病大鼠腎臟細胞間纖連蛋白和膠原Ⅳ蛋白表達的影響

陳　偉,田　魯,王 　港,李　易，2*

(1.黃石市中心醫院腎內科，湖北 黃石 435000；2.湖北理工學院醫學院，湖北 黃石 435000)

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苦瓜總皂苷對2型糖尿病腎病大鼠腎臟細胞間纖連蛋白和膠原Ⅳ蛋白表達的影響

陳偉1,田魯1,王 港1,李易1，2*

(1.黃石市中心醫院腎內科，湖北 黃石 435000；2.湖北理工學院醫學院，湖北 黃石 435000)

摘要：目的探討苦瓜總皂苷對2型糖尿病腎病大鼠細胞間纖連蛋白(FN)和膠原Ⅳ蛋白(Ⅳ-CP)表達的影響。方法雄性SD大鼠48只隨機分為正常對照組、2型糖尿病腎病模型組及苦瓜總皂苷5 mg/(kg·d)，治療組左腎切除加1次大劑量鏈脲佐菌素腹腔注射建立動物模型，正常對照組和模型組給予生理鹽水灌胃，苦瓜總皂苷治療組給予苦瓜總皂苷灌胃，分別于實驗第4、8周處死大鼠各半，測血糖、24 h尿蛋白定量以及炎性因子；免疫組化、RT-PCR以及Western Blot檢測FN和Ⅳ-CP蛋白的表達。結果治療組尿蛋白和血清肌酐與模型組相比明顯減少，血糖明顯升高(P<0.05)；免疫組化、RT-PCR和Western Blot與模型組相比治療組大鼠腎臟組織FN和Ⅳ-CP表達明顯降低(P<0.05)。結論苦瓜總皂苷可以通過抑制糖尿病腎病大鼠腎組織細胞間纖連蛋白和Ⅳ型膠原的表達，改善腎功能。

關鍵詞：苦瓜總皂苷;2型糖尿病腎病大鼠;纖連蛋白;Ⅳ型膠原

近年來隨著人民生活水平的提高，特別是飲食結構的改變，2型糖尿病的發病率逐年增高[1]，研究[2]顯示，控制不佳的2型糖尿病患者約三分之一可發展為糖尿病腎病。有文獻報道[3]苦瓜總皂苷對2型糖尿病有一定的治療作用，但鮮見對糖尿病腎病的研究報道，本研究通過建立2型糖尿病腎病大鼠模型并給予其苦瓜總皂苷干預，以期明確在治療2型糖尿病腎病方面的作用機制，為本藥的開發與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1動物選取清潔級雄性SD大鼠48只，體質量180～200 g，購自華中科技大學動物實驗中心，大鼠合格證號為SCXK(鄂)2010-0009，適應性喂養2周后行相應實驗。

1.2動物分組及造模方法大鼠隨機分成正常對照組、2型糖尿病腎病模型組以及苦瓜總皂苷干預治療組3組，其中糖尿病腎病組和模型組施行單側腎切除手術:1)用1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)將大鼠麻醉，麻醉后將其固定于固定板上；2)切開大鼠腹部找到左腎；3)將大鼠左腎蒂部位結扎并摘除，之后給予青霉素腹腔注射后縫合；4)正常組大鼠采用同樣方法處理大鼠，但腎臟不摘除。5)術后每天給予大鼠肌注1次青霉素，時間為1周。后予大鼠再飼養3周，3周后，糖尿病腎病組以及模型對照組大鼠給予鏈脲佐菌素50 mg/kg行1次性腹腔注射，注射3 d后尾靜脈取血，取血后血糖儀測定血糖，測定空腹血糖大于16.7 mmol/L的大鼠判定為造模成功。

模型建立成功后，正常對照組和模型組給予生理鹽水灌胃，苦瓜總皂苷治療組給予苦瓜總皂苷灌胃，模型成功后于實驗2、4、6、8周末分別測大鼠血糖水平；分別于實驗第4、8周處死大鼠各半，測24 h尿蛋白定量；取腎組織做HE染色行腎組織病理觀察、RT-PCR以及Western Blot檢測腎組織FN和IV-CP蛋白和mRNA表達。

1.3標本收集

1.3.1尿液標本收集分別于治療4、8周后，每組隨機取8只大鼠置于代謝籠收集24 h尿液并計算總尿量。24 h尿蛋白量采用公式為：24 h尿蛋白量(mg)=尿蛋白濃度(g/L)×24 h尿量(mL)。

1. 3.2血液標本收集第2、6周采用斷尾法收集大鼠血液，第4、8周與禁食12 h后，用10%水合氯醛(2.0 mL/kg)給予大鼠腹腔注射麻醉。麻醉完成后沿大鼠腹中線切開皮膚和肌肉，將心臟暴露，之后用10 mL注射器插入心尖取血，取血后摘除右腎備用檢測。全自動生化分析儀測定血清白蛋白及血清肌酐值。

1.4免疫組化肝臟組織切片后室溫中平衡10 min之后用預冷丙酮固定后晾干，晾干后采用PBS緩沖液沖洗3次，沖洗完成后用0.3%的H2O2室溫浸泡10 min，再用PBS緩沖液沖洗3次；滴加一抗，16 h后，采用PBS緩沖液沖洗3次后滴加二抗，室溫孵育1 h。PBS再沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復染，水洗后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察結果。

1.5RT-PCR檢測大鼠腎組織中FN和IV-CP mRNA表達腎臟組織用天根總RNA試劑盒提取后，定量，并行逆轉錄擴增反應，擴增條件如下：94 ℃預變性2 min，1個循環；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環；72 ℃總延伸6 min。引物序列見表1。

表1　纖連蛋白和Ⅳ型膠原引物

1.6Western Blot檢測大鼠腎組織中纖連蛋白和Ⅳ型膠原蛋白表達稱取100 mg腎臟組織，電子勻漿機磨碎，低溫高速勻漿機離心，4 000 r/min，離心后取上清液分裝于1 mL的離心管中并置于超低溫冰箱中保存，電泳時每組各取樣本60 μg進行蛋白電泳，電泳方法按照文獻[4]進行，收集到電泳圖片后用Image J計算各條帶的灰度值，Image J計算灰度值。

2結果

2.1實驗大鼠一般情況從造模成功后開始記錄大鼠一般情況，正常組大鼠飲食、飲水、精神狀態以及平常活動均正常，同時毛發光滑；模型組大鼠均呈現出明顯的多尿、多飲、多食等癥狀，其精神明顯不佳，此外毛發可見其明顯雜亂，同時表現有淡黃色(可能沾有尿液)，治療組大鼠在治療4周后相較于正常組飲食也呈增加的趨勢，但沒有模型組增加量大，治療8周后與治療4周后基本一致。

2.2大鼠血糖、24 h尿蛋白定量及血肌酐和血漿白蛋白變化見表2、表3。

表2　對大鼠血糖變化的影響　mmol/L

注：與模型組相比，#P<0.05

表3　對大鼠24 h蛋白尿量、血肌酐和血漿白蛋白變化的影響±s，n=18)

注：與模型組相比，#P<0.05

2.3大鼠腎臟組織中FN和IV-CP mRNA表達見表4。

2.4大鼠腎臟組織中FN和IV-CP 蛋白表達見表5。

組 別FN治療4周治療8周IV-CPmRNA治療4周治療8周正常組1.24±0.241.23±0.25 0.83±0.17 0.92±0.24 模型組2.35±0.461.64±0.26 1.41±0.15 1.69±0.19 治療組1.29±0.261.31±0.23#1.06±0.16#1.02±0.17#

注：與模型組相比，#P<0.05

組 別FN治療4周治療8周IV-CP治療4周治療8周正常組0.87±0.19 0.89±0.17 1.27±0.26 1.15±0.18 模型組1.86±0.28 1.72±0.27 3.22±0.27 3.42±0.26 治療組1.59±0.31#1.54±0.16#1.93±0.26#1.82±0.32#

注：與模型組相比，#P<0.05

2.5FN和IV-CP免疫組化免疫組化可見，空白組大鼠腎臟組織中FN和IV-CP呈低表達狀態，模型組FN和IV-CP表達明顯升高，苦瓜總皂苷治療4周后有一定降低，治療8周后進一步降低。

3討論

關于2型糖尿病腎病發病機制的研究目前有許多的學說[5-10],研究較多的有基因氧化應激學說、遺傳學說、炎癥學說、代謝障礙學說、血流動力學改變學說等，但具體為哪種發病機制造成本病的發生以及后續進展目前還沒有明確的定論，但不管是哪種機制，哪種信號通路影響，其對腎臟的改變是毫無疑問的。腎臟組織學改變除了研究中較多見到腎小球肥大、腎小球炎癥等外，在腎臟細胞間的細胞外基質聚集、基底膜增厚等也是最典型的特點。目前國外許多專家均將細胞外基質的積聚作為治療糖尿病腎病進展的一個熱點，關于腎臟中細胞外基質的常見蛋白有纖維連接蛋白、Ⅴ型膠原蛋白、Ⅳ型膠原蛋白、層黏連蛋白以及一些蛋白多糖等。當腎臟受到長期的高血糖、高炎性因子浸潤后，可造成腎臟細胞發生炎癥反應，從而腫脹，這種細胞的腫脹又可造成病理和細胞外基質轉錄蛋白的激活，進而分泌過量的細胞外基質蛋白，最終造成腎臟的損害和進展[11-15]。

苦瓜其本身屬于葫蘆科苦瓜屬植物苦瓜MomordicacharantiaL的未成熟果實的一種，也是我國常見的菜系，但關于其藥用機理人們了解甚少，苦瓜有著悠久的入藥史，其中《本草綱目》描述，苦瓜苦寒無毒，其可解勞乏，除邪熱，清心明目。現代許多學者對苦瓜進行了大量的研究，研究均提示苦瓜具有明顯的抗氧化、提高免疫力、降血糖、降低膽固醇、甚至可以抗艾滋病病毒的作用[16-17]。本次作者用苦瓜總皂苷治療2型糖尿病腎病大鼠，研究顯示：苦瓜總皂苷不僅有降低血糖的作用，同時也可明顯改善2型糖尿病大鼠24 h尿量、尿蛋白以及血清肌酐；同時也可抑制大鼠腎臟細胞間FN和IV-CP蛋白和mRNA的表達，具有很好的藥用價值。

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Total saponins of bitter gourd to fibronectin and collagen Ⅳ in type 2 diabetic nephropathy rat

CHEN Wei1,TIAN Lu1,WANG Gang1,LI Yi1,2*

(1.Department of Kidney,Huangshi Central Hospital,Huangshi 435000,Hubei Province,China;2.Medical College,Hubei Polytechnic University,Huangshi 435000,Hubei Province,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of total saponins from bitter to the expression of fibronectin and collagen Ⅳin 2 diabetic nephropathy rats.MethodsMale SD rats were randomly divided into normal control group,diabetic nephropathy model group and saponins treatment group (5 mg/kg·d treatment) and left renal resection plus a large dose of streptozocin (STZ) intraperitoneal injection of established animal model,after successful built model,normal control group and model group were given physiological saline by gavage,treatment group give saponins gavage,respectively in the 4 weeks,8 weeks half of rats were sacrificed,measuring glucose,24 h urine protein quantitative and inflammatory factors;immunohistochemistry,RT-PCR and Western blot detection of renal fibrosis even protein and collagen Ⅳ expression.ResultsThe serum creatinine and serum creatinine in the treatment group were significantly decreased compared with the model group,the difference was significant (P<0.05);After treatment,Immunohistochemistry,RT-PCR and Blot Western showed that:compared with the model group,the expression of fibronectin and type Ⅳ collagen protein in the kidney tissue was significantly lower than that in the treatment group (P<0.05).ConclusionTotal saponins from bitter gourd can inhibit the expression of fibronectin and type Ⅳ collagen in renal tissue of diabetic nephropathy rats,and improve renal function.

Keywords：total saponins of bitter gourd;type 2 diabetic nephropathy rats;fibronectin;Ⅳ collagen protein

(收稿日期:2015-10-09)

文章編號：2095-6258(2016)02-0237-04

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

*通信作者：李易，女，碩士，副主任醫師，電話-13597617350，電子信箱-hsyiyuantougao@163.com

作者簡介：陳偉(1980-)，男，碩士研究生，主治醫師，主要從事腎病的內科治療及腎臟透析。

基金項目：湖北省科技廳面上項目“苦瓜總皂苷對2型糖尿病腎病大鼠的治療作用”(2013FFA003)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.006