不同刺激量針刺關元穴對寒凝類痛經模型大鼠的影響

崔　曉，周　瑾，張　梅，劉珍珍，楊佳敏，齊丹丹，郭孟瑋，2，趙雅芳，2，李曉泓，任曉暄，2，張露芬，2*

(1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.國家中醫藥管理局針灸生物學三級實驗室，北京 100029)

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不同刺激量針刺關元穴對寒凝類痛經模型大鼠的影響

崔曉1，周瑾1，張梅1，劉珍珍1，楊佳敏1，齊丹丹1，郭孟瑋1，2，趙雅芳1，2，李曉泓1，任曉暄1，2，張露芬1，2*

(1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.國家中醫藥管理局針灸生物學三級實驗室，北京 100029)

摘要：目的觀察不同的針刺刺激量施于關元穴對寒凝類痛經模型大鼠子宮組織中收縮素受體(OTR)及肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)含量的影響。方法將處于動情間期3月齡的SD雌性大鼠32只，隨機分為鹽水組、寒凝類痛經模型組24只,造模成功后將寒凝類痛經模型組又分為模型組、刺激量A組和刺激量B組，每組8只。除鹽水組外，模型組、刺激量A組和刺激量B組均采用全身冷凍法結合苯甲酸雌二醇注射法造模。鹽水組和模型組不予針刺，刺激量A組予以粗針、深刺、行手法；刺激量B組予以細針、淺刺、不施手法。采用熒光定量PCR方法檢測大鼠子宮組織中縮宮素受體(OTR)的含量。采用ELISA(酶聯免疫法)測量大鼠子宮組織中MLCK的含量。結果與鹽水組比較，模型組的子宮收縮波個數、波峰峰值、活動度及MLCK水平均升高 (P<0.01)；與模型組比較，刺激量A組的子宮收縮波個數明顯減少(P<0.05)、MLCK含量明顯降低 (P<0.01)，刺激量B組的OTR mRNA相對表達量降低 (P<0.05)；與刺激量A組比較，刺激量B組收縮波個數增多 (P<0.05)、OTR mRNA相對表達量降低(P<0.01)。結論不同刺激量針刺關元穴對寒凝類痛經模型大鼠的效應有所不同，粗針、深刺、行手法的效應較強于細針、淺刺、不行手法的針刺效應，提示針刺的刺激量也是決定針刺療效的因素之一。

關鍵詞：針灸療法；穴，關元；寒凝類痛經；OTR；MLCK

痛經是目前臨床常見的婦科疾病之一，也是以在行經前后或行經期間出現腹痛，痛引腰骶，下腹墜脹等為主要表現的月經病之一。其發病所引發的不適會嚴重影響多數女性患者的生活和工作質量，因此其越來越受醫學者的關注。現代針灸療法在治療痛經疾病中療效確卓[1-2]，成為痛經主要的治療手段之一和重點研究方向。由于針灸在治療疾病方面的機制尚不清楚，現對針刺關元穴從不同刺激量入手，觀察其對寒凝類痛經模型大鼠子宮相關物質的影響，探討不同刺激量對針刺鎮痛效應的影響差異及部分機制。

1材料

1.1動物采用清潔級(SD)大鼠，雌性，鼠齡3個月，體質量(240±20)g，性成熟未交配。飼養條件：室內溫度(23±1)℃，濕度(45±5)%，日光燈光照，普通清潔級鼠飼料，自由飲用自來水。在飼養過程中對大鼠進行陰道篩查，選擇處于動情間期的大鼠32只，納入實驗。

1.2儀器、試劑及耗材BC/BD-379HB臥式冰柜:青島海爾集團；BT223S電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；電熱恒溫水浴箱，北京市醫療設備廠；MDF-u50A型超低溫冰箱，日本三洋公司；FT-100張力換能器，成都泰盟科技有限責任公司；PRISM7700 型熒光定量 PCR儀，美國應用生物公司；苯甲酸雌二醇注射液，寧波市三生藥業有限公司，批號:120207；縮宮素注射液：上海禾豐制藥廠生產，批號：120302；自制美蘭染色溶液；20%烏拉坦注射液：批號T20080530。

2方法

2.1實驗動物適應性飼養1 周后，對大鼠進行陰道動情周期篩查,每日定時用細棉簽蘸以生理鹽水濕潤后輕輕插入大鼠陰道約0.5 cm，稍微轉動后取出，將帶有陰道內容物的細棉簽在載玻片上均勻轉動涂片，在空氣中干燥。美蘭染色10 min，用清水將美蘭輕輕沖掉，然后在顯微鏡下觀察陰道涂片的組織學變化，根據細胞形態、種類及數量篩選出動情間期大鼠。將處于動情間期的32只雌性SD 大鼠，按照隨機數字法分為鹽水對照組 8 只，寒凝證類痛經模型組24只，造模結束后將寒凝類痛經模型組分為模型組、刺激量 A 組(粗針、深刺、行手法) 與刺激量B組(細針、淺刺、不施手法)，每組各8 只。

2.2模型制備根據前期本課題組實驗研究，采用動情間期SD大鼠全身冷凍法配合苯甲酸雌二醇注射法可成功建立寒凝類痛經大鼠模型[3-5]。其制備方法為:除鹽水組外，其余各組大鼠采用全身冷凍法制備寒凝證模型，即第1～5天將大鼠(每8只1籠) 放入-25 ℃冰柜冷凍4 h，2 h后打開冰柜換氣5 s，同時給予苯甲酸雌二醇注射，第1天及第10天日注射 0.5 mg /只，余日均0.2 mg /只，鹽水組每日給予同等劑量的生理鹽水。模型組及針刺組于末次給藥1 h后，腹腔注射縮宮素2 U/只，鹽水組在皮下給予生理鹽水1 h 后，腹腔注射生理鹽水2 U/只。2.3穴位選取與定位根據大鼠形態、解剖以及生理特點，參照張露芬主編《實驗針灸學》穴位標準定位，“關元”：在大鼠臍(兩髂棘連線的中點)下約25 mm處。2.4針刺方法針刺組和模型組在第10天注射縮宮素后，刺激量A組用Φ 0.25 mm×40 mm毫針針刺大鼠關元穴4～5 mm，且刺入即刻和留針10 min時分別施平補平瀉手法30 s；刺激量B組用Φ 0.18 mm×13 mm毫針針刺大鼠關元穴1～2 mm，不行手法。2組均留針20 min。模型組和鹽水組不予針刺處理。

2.5指標檢測

2.5.1子宮收縮強度第10天注射苯甲酸雌二醇后，將大鼠予以肌注20%烏拉坦溶液，大鼠麻醉后，手術切開腹部，尋找子宮“Y”型交叉處，在一側子宮的分叉上1 cm處穿線，線的另一端連接于張力傳感器上，加0.1 g的負荷，用BL-420F生物機能實驗系統記錄儀記錄子宮的收縮波，首先記錄其在5 min內的基礎波形，然后將2 U縮宮素滴在子宮上，繼續標記，針刺組需分別標記針刺即刻、針刺時、針刺20 min結束，停止標錄，記錄子宮收縮波個數、子宮收縮波峰值及子宮活動度(子宮收縮波個數×波峰峰值)。

2.5.2熒光定量法檢測子宮OTR水平的表達1)子宮組織提取：取大鼠的子宮，稱重，放入EP管中，置液氮凍存5 min后，置于-80 ℃冰箱內保存待測。2)RNA提取：RNA 提取按 Trizol 提取試劑盒操作說明書進行。EP管于室溫內解凍1 h后,于自動振蕩器上震蕩1 min后常溫放置10 min；加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫孵育2～3 min；12 000 r/min離心15 min；取上清液至新 EP管內,加入0.5 mL異丙醇，顛倒混勻后，常溫靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清液；75% 冷乙醇洗滌沉淀1次，7 500 r/min離心5 min，棄乙醇，空氣或真空干燥10 min；加 DEPC 處理水溶解RNA 10 min，提取的RNA純度由OD260/280鑒定。3)cDNA 制備：根據Promega ImProm-IITMReverse Transcription System試劑盒加入隨機引物及模板引物進行逆轉錄，在PCR儀上設置反應條件為：25 ℃ 5 min；42 ℃1 h；70 ℃15 min，終止反應取出。冰浴冷卻后置-20 ℃ 保存。4)熒光定量 PCR反應：根據NCBI數據庫中OTR及β-actin基因序列，以Primer Premier 5.0軟件設計引物，由北京生工生物工程(上海)股份有限公司合成(OTR引物上游5’-TTGCTGGGCGGTCTTCAT-3’下游5’-TCATCTTCACCGTGCGGATTT-3’產物長度269 bp；內參β-actin引物上游5’-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3’下游5’-CGTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATGGAGG-3’產物長度283 bp)。按以下反應體系進行:25 μL PCR反應體系中含 Taq酶0.2 μL，10 xbuffer 2.5 μL,cDNA 4μL，dNTP 0.5 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5μL,去離子水16.8 μL。擴增條件為 95 ℃ 3 min 預變性,94 ℃ 30 s變性，(退火溫度)×30 s退火(OTR 58 ℃、β-actin 59 ℃)，72 ℃ 1 min延伸，共 40 個循環，最后是72 ℃延伸7 min。

2.6子宮中MLCK陽性水平表達的檢測采用ELISA(酶聯免疫法)測量大鼠子宮組織中MLCK的表達水平。嚴格按試劑盒說明書操作程序。

3結果

3.1不同刺激量針刺關元穴對寒凝類痛經模型大鼠子宮收縮強度的影響見表1。

組 別收縮波個數/個波峰峰值/g活動度/(個/g)鹽水組 6.00±3.63 0.13±0.05 0.75±0.41 模型組 12.75±4.43##0.36±0.25##4.23±2.42##刺激量A組7.88±2.36△ 0.32±0.21# 2.14±0.81##刺激量B組10.63±2.26#▲0.37±0.21##4.09±2.61##

注：與鹽水組比較，#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與刺激量A組比較，▲P<0.05

3.2不同刺激量針刺關元穴對寒凝類痛經模型大鼠子宮OTR、MLCK的影響見表2。

組 別OTRmRNA相對表達量(2-△△Ct)MLCK/(pg/mg)鹽水組 4.59±0.92 9.13±1.69 模型組 3.50±10.84 12.69±1.75##刺激量A組4.69±1.40 10.49±0.93△△刺激量B組2.23±1.47##△▲▲11.29±1.32##

注：與鹽水組比較， ##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與刺激量A組比較，▲▲P<0.01

4討論

痛經是臨床上較為常見的婦科病之一[6]，而從中醫辨證角度分析，寒濕凝滯導致胞宮氣血瘀滯是目前臨床痛經發病的主要病機之一[7-8]，本課題前期大量研究證實全身冷凍法加苯甲酸雌二醇聯合縮宮素可成功制備寒凝類痛經模型大鼠，且該模型所表現的表征特點均較為符合中醫寒凝證的證候特征[9-10]。故本實驗選擇寒凝類痛經模型大鼠為研究媒介，探討不同刺激量對針刺療效的影響。

關元穴是任脈與足三陰經的交會穴，具有培元固本、溫陽散寒、調補沖任的功效，臨床上多用于生殖系統疾病。《類經圖翼》中提到“此穴又名大中極，乃男子藏精，女子蓄血之處……主治積冷，諸虛百損，臍下絞痛，漸入陰中等。”此穴又為小腸之募穴，可集聚小腸經氣血，傳導任脈水濕，可通利任脈，通則不痛。現代臨床和實驗研究[11-12]均表明，關元穴可有效改善經期伴隨的一系列不適癥狀。因此本實驗選擇針刺關元穴作為干預手段，初步探討不同刺激量對針刺療效的影響。

痛經明顯的病理表現即為子宮平滑肌的異常收縮，這也是疼痛產生的主要原因之一。而在這一病理過程中，子宮平滑肌細胞上的縮宮素受體(OTR)可通過與縮宮素結合升高胞內Ca+濃度，發揮收縮子宮平滑肌的作用。繼而Ca+濃度的改變可調控MLCK活性，使其磷酸化，引發肌動蛋白和肌球蛋白相互作用，從而起到使子宮平滑肌收縮的作用[13-14]。在這一連鎖反應當中，縮宮素受體(OTR)與肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)均是關鍵因素之一，隨著MLCK和OTR增加，肌絲運動速度增強，平滑肌收縮增強[15-16]。故本實驗觀察OTR與MLCK陽性表達水平的變化特點，用以揭示不同刺激量下針刺對寒凝類痛經的影響機制，并進一步闡釋針刺刺激量對針刺效應的影響。

本實驗結果顯示：針刺關元穴可以明顯減少寒凝類痛經模型大鼠的子宮收縮波個數，有效抑制子宮活動度的異常增強。不同的刺激量下，子宮的收縮波、收縮波波峰峰值、子宮活動度、子宮MLCK的含量均有不同程度的降低，提示針刺關元穴對子宮收縮強度具有一定的良性調節作用，并且刺激量A組的效應表現優于刺激量B組。然而在本實驗結果中OTR mRNA的相對表達量與實驗結論呈現相反的表現趨勢，這種異常表現可能與子宮內在調節機制有關，有關報道[17]曾提示，長時間的收縮素(OT)刺激會出現OTR脫敏現象，故而在機體調節中，也可能會因為長時間疼痛反應的刺激，外加本實驗造模過程中注射縮宮素，誘發此現象產生，導致OTR mRNA相對表達量呈現異常表達。也有可能因為子宮內膜和子宮平滑肌均存在收縮素受體(OTR)，而不同的環境刺激會誘導縮宮素與不同位置的受體結合,故而不同的針刺條件下也可能誘發不同的調節途徑，導致OTR mRNA相對表達量表現不同[18],從而出現本實驗治療組OTR mRNA的差異結果。

綜上所述，分析認為不同刺激量下針刺關元穴對寒凝類痛經模型大鼠的效應有所不同，粗針、深刺、行手法的療效較細針、淺刺、不行手法的針刺效應佳，提示針刺的刺激量也是決定針刺療效的因素之一。

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Different acupuncture stimulus at“Guanyuan(RN4)”on dysmenorrheal rats model with cold syndrome

CUI Xiao1,ZHOU Jin1,ZHANG Mei1,LIU Zhenzhen1,YANG Jiamin1,QI Dandan1,GUO Mengwei1,2,ZHAO Yafang1,2,LI Xiaohong1,REN Xiaoxuan1,2,ZHANG Lufen1,2*

(1.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.Acupuncture Biology Ⅲ Laboratory of State Administration of TCM,Beijing 100029,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the analgesia mechanism of different acupuncture stimulus at “Guanyuan(RN4)” on dysmenorrheal rats model with cold syndrome by observing the concnet of contraction receptor (OTR) and myosin light streptokinase (MLCK) of uterine tissue in rats.MethodsThe 32 female SD rats at diestrus with 3 months aged were randomized into 4 groups,including a saline control group，a cold stagnation of dysmenorrheal model control group,an A stimuli group and a B stimuli group,with 8 rats in each group.Except the saline control group rats given intraperitoneal injection 0.9% Nacl,in the rest groups rats were treated with the whole body freezing method combined with estradiol benzoate injection mold.ResultsExcept the saline control group and model control group,the acupuncture groups acupunctured the RN4 point for 20 min after modeling,the A stimuli group needled acupoint with thick needle and insert deeper with manipulation;the B stimuli group with fine needle and insert shallowly without manipulation.Observe the OTR by Polymerase Chain Reaction (PCR) and MLCK by ELISA in uterine of 8 rats in each group.ConclusionDifferent acupuncture stimulus at RN4 on experimental cold syndrome of dysmenorrheal model rats have different effect,inserting deeper with thick needle and exerting manipulation is better than fine needle and inserting shallowly without manipulation.It indicate that different acupuncture stimulus is one of the vital factors to determine the acupuncture therapeutic efficacy.

Keywords：acupuncture therapy;point,Guanyuan,RN4;dysmenorrheal with cold syndrome;OTR;MLCK

(收稿日期:2015-10-09)

文章編號：2095-6258(2016)02-0241-04

中圖分類號：R246.2

文獻標志碼：A

*通信作者：張露芬，電話-13641280192，電子信箱-zhlufen@aliyun.com

作者簡介：崔曉(1989-)，女，碩士研究生，主要從事針灸的神經生物學機制研究。

基金項目：國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)資助項目(2012CB518506)；國家中醫藥管理局針灸特色療法評價重點研究室。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.007