蜈蚣提取物抗肺癌活性的體內外實驗研究

陳園 艾小佳 王志琪 田莎 周青 裴剛 田雪飛

摘要：目的 探討蜈蚣提取物對人肺癌A549細胞的增殖抑制、凋亡誘導及裸小鼠皮下移植瘤生長的抑制作用。方法 采用酶解法合丙酮沉淀法分離純化蜈蚣提取物處理人肺癌A549細胞，MTT法檢測細胞增殖抑制并計算半數抑制率（IC50），流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期變化，Hoechst熒光染色觀察細胞凋亡的形態變化。制備人肺癌細胞裸小鼠皮下移植瘤模型，隨機分為模型組、對照組和蜈蚣提取物組，每組10只，觀察裸小鼠皮下移植瘤瘤體體積、質量及抑瘤率變化。結果 體外實驗結果顯示，蜈蚣提取物對人肺癌A549細胞有明顯的增殖抑制作用，IC50為0.603 mg/mL；蜈蚣提取物作用48 h后，細胞周期表現為G0/G1期細胞比例下降，S期與G2/M期細胞比例均升高，與對照組比較差異有統計學意義（P<0.01）；Hoechst熒光染色可觀察到明顯的凋亡細胞及凋亡特征性的形態學改變；動物體內抑瘤實驗結果發現，經蜈蚣提取物治療后，瘤體質量與體積顯著減少，與模型組比較差異有統計學意義（P<0.01）。結論 蜈蚣提取物對人肺癌A549細胞具有濃度依賴性增殖抑制作用，可誘導細胞凋亡，使A549細胞停滯于G2/M期，并能有效抑制人肺癌裸小鼠皮下移植瘤的生長。

關鍵詞：蜈蚣提取物；肺癌；細胞凋亡；移植瘤；小鼠

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）05-0061-03

Study on Anti-lung Cancer Efficiency of Centipede Extracts in Vitro and Vivo Experiments CHEN Yuan1， AI Xiao-jia1， WANG Zhi-qi1， TIAN Sha1， ZHOU Qing2， PEI Gang1， TIAN Xue-fei1 （1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）

Abstract： Objective To investigate efficiency of centipede extracts on apoptosis induction， proliferation inhibition to Human A549 cell line and growth suppression of subcutaneous transplanted sarcoma in nude mice. Methods Centipede extracts prepared by enzymolysis and acetone precipitation methods were used to treat human lung cancer A549 cell line. Proliferation inhibition was evaluated by MTT assay and half inhibit concentration （IC50） was calculated. Cell morphological change and apoptosis were detected by flow cytometry and Hoechst stain. The subcutaneous transplanted sarcoma models were prepared with nude mice and randomly divided into model group， control group and centipede extracts group， with 10 mice in each group. Changes of tumor volume， quality and anti-tumor rate were observed. Results In vitro experiment， proliferation of A549 cells was inhibited with dose-dependency and IC50 value was 0.603 mg/mL. The G0/G1 phase of cells was down regulated and G2/M and S phase cells were up-regulated. The apoptotic character cells were been found by Hoechst stain. In vivo experiment， the tumor weight and volume decreased significantly compared with model control group， with statistical significance （P<0.01）. Conclusion The centipede extracts shows dose-dependent anti-proliferative effect on A549 cells， which can induce apoptosis by arresting A549 cells at G2/M phase and suppressing growth of subcutaneous transplanted sarcoma of lung cancer in nude mice.

Key words： centipede extracts； lung cancer； apoptosis； implanted tumor；mice

基金項目：國家自然科學基金（81473617）；湖南省自然科學基金重點項目（13JJ2032）；湖南省教育廳重點資助項目（10A089）

通訊作者：田雪飛，E-mail：windsame@163.com

肺癌已成為全球嚴重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤，其發病率和病死率位居首位[1]。肺癌屬中醫“肺積”“咳嗽”“積聚”等范疇。徐振曄認為本病最基本的病理機制是癌毒痰瘀膠結于肺部，實證多為毒聚、痰凝、氣滯、血瘀[2]。劉偉勝提出肺癌發病基礎是正虛，直接因素是癌毒，治宜扶正配以軟堅散結、清化瘤毒[3]。胡國良認為，凡腫瘤皆邪氣密結不散，屬實證，主張攻補兼施，攻以峻猛攻毒散結，補以甘溫補益[4]。蟲類藥抗腫瘤作用一直頗受關注，蜈蚣作為一種重要的蟲類藥物，其攻毒散結的功效在臨床治療肺癌中藥復方配伍中應用廣泛[5-6]。本實驗對蜈蚣有效成分的分離純化、抗肺癌活性進行了研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級純系BALB/C-nu/nu雄性裸小鼠30只，4～6周齡，體質量（20±3）g，重慶斯萊康動物藥業有限公司，許可證號SCXK（湘）2009-0004。飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心SPF級實驗室。

1.2 細胞株

人肺癌A549細胞株，購于湘雅醫學院細胞中心。用含12%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培養基，置37 ℃、5%CO2飽和濕度的恒溫孵育箱中培養。

1.3 藥物及制備

少棘蜈蚣，湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科，提取物制備參照文獻[7]方法改進。蜈蚣超微粉末2 g，55 ℃蛋白酶酶解后，99 ℃水浴中滅活10 min，4 ℃、5000 r/min離心10 min，取上清液，2倍體積預冷丙酮沉淀，4℃、5000 r/min離心10 min，取沉淀，超純水充分溶解沉淀，重復2次。收集最后沉淀，超純水溶解，加2倍體積預冷丙酮，取沉淀，30 ℃真空干燥成粉末，-20 ℃凍存備用。順鉑，齊魯制藥有限公司，批號5110351DB。

1.4 主要試劑及儀器

高糖DMEM培養基（美國GIBCO公司），FBS（美國INVITROGEN公司），磷酸鹽緩沖液（PBS，武漢博士德有限公司），二甲基亞砜（DMSO，美國AMRESCO公司），噻唑藍（MTT）、Hoechst33342熒光染料（美國SIGMA公司）。CO2培養箱（美國Therrmo公司），Elx808型酶標儀（美國BioTek公司），BX20型熒光顯微鏡攝像機（日本Olympus公司），FACScan型流式細胞儀（美國BD公司）。

1.5 細胞增殖抑制率測定

取對數生長期A549細胞制成單細胞懸液，調整濃度為5×104個/mL，接種于96孔板，每孔200 μL，蜈蚣提取物干預設置7個濃度梯度（2.500、1.250、0.625、0.313、0.15、0.078、0.039 mg/mL），同時設對照組和空白組（調零孔），均設5個復孔，其中對照組接種細胞加入完全培養基，空白組只加入完全培養基。MTT法檢測參照說明進行，計算細胞生長抑制率（%）[1-（OD值藥物組÷對照組OD值）]×100%，采用直線回歸方程計算半數抑制率（IC50）。

1.6 細胞凋亡及細胞周期檢測

取對數生長期A549細胞，濃度為1×105個/mL，接種于6孔培養板中，設置蜈蚣提取物組和對照組，其中蜈蚣提取物組加入IC50濃度藥液處理，對照組加入等量完全培養基，每孔2 mL。蜈蚣提取物處理48 h后流式細胞術檢測細胞凋亡率和細胞周期。Hoechst熒光染色觀察細胞凋亡形態。

1.7 人肺癌裸小鼠皮下移植瘤模型制備

取對數生長期A549細胞，濃度為1×107個/mL，接種于裸小鼠背部皮下，每只0.2 mL，接種后第7日成瘤。將30只裸小鼠隨機分為模型組、蜈蚣提取物組、順鉑組，每組10只。接種后第8日給予藥物灌胃，動物給藥量按人和動物體表面積折算為成人5倍劑量。取蜈蚣提取物12 mg加入生理鹽水至8 mL，配成含0.06 g原藥材/mL藥液，每次灌胃0.4 mL/只，2次/d；順鉑組予2 mg/kg劑量腹腔內注射，1次/3 d；模型組予等劑量生理鹽水灌胃。連續18 d。各組小鼠治療后第19日脫頸處死。實驗過程中觀察動物一般的狀況，繪制腫瘤體積增長曲線并計算其抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型組平均瘤質量-治療組平均瘤質量）÷模型組平均瘤質量×100%。

1.8 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，2組間比較采用成組t檢驗；多組比較采用方差分析，組間比較采用SNK法。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

蜈蚣提取物組動物給藥期間飲食、精神可，對外界刺激反應靈敏，大小便正常；順鉑組給藥后第4日出現飲食減少，精神尚可，對外界刺激反應尚靈敏，大便稍溏，小便正常；模型組第3日后開始出現消瘦，精神欠佳，對外界刺激反應不靈敏，飲食飲水量減少，大便溏，小便正常。

2.2 蜈蚣提取物對人肺癌A549細胞增殖抑制、細胞周期及誘導凋亡的影響

MTT法檢測結果顯示，蜈蚣提取物對人肺癌A549細胞增殖有明顯抑制作用（P<0.05），呈劑量依賴性。蜈蚣提取物增殖抑制率回歸方程為：Y=24.807X+35.174。經計算IC50為0.603 mg/mL。以IC50濃度蜈蚣提取物作用于人肺癌A549細胞48 h后，與對照組比較，G0/G1期細胞百分含量下降，S期與G2/M期細胞比例均升高（P<0.05）。Hoechst熒光染色結果顯示，蜈蚣提取物處理后A549細胞出現核染色質濃縮、凝聚，密度升高，細胞核被致密濃染，出現顏色發白等特征性凋亡表現，見圖1。流式細胞儀檢測結果顯示，蜈蚣提取物組可見大量細胞凋亡，凋亡率達63.48%。結果見表1。

2.3 蜈蚣提取物對人肺癌A549細胞裸小鼠皮下移植瘤瘤體體積、質量及抑瘤率的影響

灌胃過程中測量皮下移植瘤第8、16、25日體積，蜈蚣提取物組分別為（126.0±11.2）、（171.5±13.3）、（196.0±20.8）mm3，順鉑組分別為（113.7±8.9）、（134.5±9.1）、（183.8±13.5）mm3，模型組分別為（320.0±24.6）、（786.5±31.1）、（1912.5±56.4）mm3，蜈蚣提取物組和順鉑組皮下移植瘤體積生長速度較模型組明顯減慢（P<0.01），見圖2。給藥18 d后，蜈蚣提取物組皮下移植瘤瘤體質量為（2.94±0.76）g明顯低于模型組[（4.65±0.91）g]（P<0.05）；與順鉑組[（2.52±0.69）g]比較無明顯差異；蜈蚣提取物組抑瘤率為36.77%較順鉑組45.81%比無明顯差異。

3 討論

蜈蚣是我國傳統名貴中藥材，現代藥理研究顯示，蜈蚣具有降低血黏度、抗炎、抗菌、鎮痛、抗驚厥等多種作用[8]。蜈蚣具有“攻毒散結”的功效特點，以復方配伍的形式應用于惡性腫瘤的臨床治療[9-12]。

本研究對蜈蚣抗肺癌活性進行系列體內外實驗，結果表明，蜈蚣提取物呈劑量依賴性抑制人肺癌A549細胞增殖，對肺癌細胞周期的影響主要表現為明顯的G2/M期阻滯作用，使細胞有絲分裂受阻，阻礙DNA合成，促使其凋亡。體內裸小鼠皮下移植瘤實驗結果也提示，蜈蚣提取物能減緩腫瘤生長速度，抑瘤率達36.77%，其療效與順鉑45.81%比較差異無統計學意義。

綜上所述，蜈蚣提取物體外可抑制肺癌細胞A549的增殖并誘導其凋亡，體內可抑制皮下移植瘤的生長速度，顯示蜈蚣具有良好的抗肺癌活性。

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