益氣養血補腎方對長期大強度運動大鼠海馬JAK/STAT信號轉導通路的影響

吳春燕等

摘 要：目的：研究復方中藥益氣養血補腎方對長期大強度運動大鼠海馬JAK/STAT信號轉導通路的影響，進一步探討該中藥的神經保護作用及機制。方法：30只雄性SD大鼠隨機分為對照組、大強度運動組和中藥組，每組10只。其中，大強度運動組和中藥組進行遞增負荷跑臺訓練，時間為7周。用TUNEL法檢測大鼠海馬細胞凋亡情況，用Western-blotting法測定海馬磷酸化JAK1、STAT1及Casepase-3的蛋白表達水平。結果：與對照組相比，大強度運動組細胞凋亡水平和p-JAK1、p-STAT1和Casepase-3的蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）；中藥組細胞凋亡水平和p-JAK1、p-STAT1和Casepase-3的蛋白表達水平則明顯低于大強度運動組（P<0.05，P<0.01）。結論：長期大強度運動可能激活JAK/STAT信號轉導通路，發揮促凋亡作用，參與腦缺血損傷后的病理生理過程；復方中藥益氣養血補腎方可能通過抑制p-JAK1、p-STAT1和Casepase-3的表達發揮腦缺血后的抗凋亡作用，從而達到神經保護作用。

關鍵詞：長期大強度運動；海馬；細胞凋亡；JAK/STAT信號通路；益氣養血補腎

中圖分類號：G804.7 文獻標識碼：A 文章編號：1006-2076（2015）03-0057-05

Abstract：Objective： To study the effects of compound Chinese medicine on the signal pathway of JAK/STAT in rat hippocampus with long-term high intensity exercise.Methods：Male SD rats were randomly divided into three groups： control group （n=10），high intensity exercise group（n=10） and Chinese medicine group （n=10）. The exercise project was applied by 7 weeks treadmill at progressive increase exercise intensity.The level of apoptosis in rat hippocampus was detected by the methods of TUNEL. The level of protein expression of p-JAK1， p-STAT1 and Casepase-3 were determined by the methods of Western blotting.Results：Compared with the control group， the level [HK][HT]

長期大強度運動可使機體腦部血流量下降，氧供相對不足，能量代謝障礙，興奮性氨基酸、氧自由基、一氧化氮等釋放增加，細胞內鈣超載，炎性細胞聚集等，出現缺血、缺氧性損傷，從而引起腦組織細胞凋亡，神經系統功能下降。細胞凋亡在腦缺血損傷中起到重要作用，信號轉導過程的激活是啟動細胞凋亡的前提，JAK（Janus kinase，JAK激酶）-STAT（signal transducers and activators oftranscription，信號傳導子和轉錄活化子）通路是與腦缺血損傷后細胞凋亡密切相關的重要細胞存活信號轉導通路之一[1]，是近年來分子生物學領域研究的熱點。腦組織缺血時引起大量細胞因子和生長因子的釋放，能夠激活JAK/STAT信號轉導系統，繼而對缺血后神經細胞的存亡有非常重要的意義，能夠調控腦缺血引起的細胞凋亡，而JAK1/STAT1信號轉導途徑是其中的一條重要路徑，與神經細胞凋亡的關系較為密切，STAT1可活化促凋亡caspase級聯反應發揮直接的促凋亡作用。

傳統的中醫藥在運動疲勞的消除方面具有獨特的優勢。中醫藥在運動疲勞的恢復方面具有獨特的優勢。在本人的前期研究中已經證實[2-3]，復方中藥益氣養血補腎方可以通過抗氧自由基，調節神經遞質水平，提高神經營養因子水平等發揮神經保護作用。本研究以JAK/STAT信號通路為切入點，通過建立大強度運動模型，觀察長期大強度運動下大鼠海馬神經細胞凋亡及JAK/STAT信號通路相關分子p-JAK1、p-STAT1和casepase-3蛋白表達水平的變化，研究該運動方式對JAK/STAT信號轉導通路的影響，探討大強度運動引起的腦缺血后神經細胞凋亡的信號轉導機制。并用復方中藥益氣養血補腎方進行干預，從細胞凋亡及JAK/STAT信號轉導通路層面進一步探討其對運動疲勞的神經生物學機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組

雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠30只，7周齡，清潔級，體重（189.2±16.7）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。適應性飼養1周后，以20 min/d的運動量篩選大鼠，將不適應跑臺訓練的淘汰，剩余的隨機分為對照組、大強度運動組和中藥組，每組10只。

1.2 運動模型的建立

對照組不進行任何運動訓練，大強度運動組和中藥組在小動物跑臺上進行跑臺訓練。采用的運動方案參考 Bedford[4]和Wisloff[5]的遞增負荷跑臺運動（并略加修改），時間為7周（具體方案見表1）。力竭標準為：大鼠不能保持預定速度，3次以上滯留于跑道后1/3處，刺激驅趕無效。行為特點表現為神精倦怠、呼吸深大，俯臥位，對刺激反應不明顯。

3 討論

3.1 長期大強度運動對大鼠海馬神經元凋亡的影響

細胞凋亡是是一種受基因調控的程序性死亡[6]，是機體維持自身穩定和適應環境必需的生理過程[7]。運動引起機體的細胞凋亡作為組織的一種自我保護機制，能夠完成組織更新、細胞替換和清除損傷等正常的生理過程。而不適當地或過度地細胞凋亡則會造成組織器官、系統功能失調與障礙，是引發運動疲勞的可能機制之一。過度或長時間力竭運動的應激反應會導致大腦的缺血缺氧，能量代謝障礙、興奮性氨基酸、氧自由基、一氧化氮等釋放增加，細胞內鈣超載，炎性細胞聚集，導致原癌基因和促凋亡蛋白的表達，啟動凋亡程序[8]。本研究用TUNEL 方法來觀察長期大強度訓練對大鼠海馬神經元凋亡的影響，結果發現，對照組只有少量的凋亡細胞（3.12±0.67），大強度運動組的大鼠海馬神經元凋亡細胞數明顯高于對照組（15.38±3.56），具有顯著性差異（P<0.01）。由此可見，長期大強度運動可能通過誘導大鼠海馬的細胞凋亡引起神經系統功能失調與障礙，這可能是運動疲勞的中樞機制之一。

3.2 長期大強度運動對JAK/STAT信號通路的影響

JAKs 激酶（ Janus kinase，JAKs）及信號轉導和轉錄激活因子（ signal transducer andactivator of transcription，STATs） 信號轉導系統是一條廣泛存在于組織中的、完整的信號轉導途徑，對細胞的生長、活化和凋亡等生理功能起重要的調節作用，是Darnell J E Jr等在研究干擾素（IFN）對細胞基因轉錄誘導的作用時發現的。細胞膜上的信號可以通過JAK/STAT信號轉導系統直接傳遞到細胞核內并啟動基因轉錄，作用直接并且傳遞速度快，其轉導過程大致如下：細胞外信號識別并結合細胞膜上的細胞因子受體，誘導受體聚化形成二聚體或三聚體，在胞漿內形成高親和性JAKs結合位點，與JAKs結合，并發生酪氨酸磷酸化而活化，活化后的JAKs進一步募集胞漿內相應的信號轉導和STATs，并使其一個羥基酪氨酸磷酸化而活化，活化后的STATs與受體親和力降低，與受體分離，形成二聚體并轉移到核內，與目的基因的特定反應元件相結合，誘導目的基因表達，促進多種蛋白質的合成，完成細胞因子受體介導的信號傳導過程，從而發揮細胞因子的多種生物學效因[9]。JAK/STAT信號途徑廣泛參與了多種細胞因子的信號轉導過程，如白介素-2、4、6（IL-2、4、6）、集落刺激因子（CSF）、生長激素等，通過調控該因子的細胞分化、增殖和凋亡等生理過程，實現免疫調節、生成造血細胞、神經和胚胎發育等多種生物學功能[10]。JAK/STAT 信號轉導途徑對缺血后神經細胞的存亡有非常重要的意義，能夠調控腦缺血引起的細胞凋亡，JAK1/STAT1 信號轉導途徑是其中的一條重要路徑，與神經細胞凋亡的關系較為密切。大量研究表明，STAT1在通過發揮促凋亡作用，參與腦缺血的神經元損傷。West等[11]在對腦缺血再灌注損傷大鼠的研究中發現，局灶性腦缺血可以通過促進STAT1的表達，誘導神經細胞的凋亡。李文濤等[12]發現慢性腦缺血大鼠STAT1蛋白在大腦皮層和海馬的陽性細胞數明顯多于非缺血大鼠，差異有統計學意義（P<0.05），并由此推論，STAT1可能參與慢性腦缺血大鼠神經細胞死亡的誘導。此外，STAT1還可以促進Casepase-3、Casepase-7、Casepase-9等的表達。Stephanou等[13]發現STAT1還可以通過抑制腦缺血再灌注損傷后抗凋亡基因Bcl-x及Bcl-2的活化和表達，發揮促凋亡作用。以上研究結果表明，STAT1可能處于信號通路級聯反應的中心環節，通過調控其下游的眾多凋亡相關基因的表達促進凋亡發生，參與腦缺血損傷。Casepase-3 是 Caspase家族中的重要成員，是哺乳動物凋亡程序中的關鍵蛋白酶，是凋亡級聯反應通路上的核心調控因子，故被稱為死亡蛋白酶[14]。Caspase-3 是細胞凋亡蛋白級聯反應的必經之路，是凋亡的關鍵酶和執行者，在凋亡程序中起最后的樞紐作用[15]。

為了探討長期大強度運動引起的腦缺血是否可激活JAK1/STAT1信號轉導通路，參與腦缺血的病理生理過程，我們建立了長期大強度運動模型，觀察大強度運動組p-JAK1、p-STAT1、Casepase-3蛋白表達水平的變化。結果發現，大強度運動組p-JAK1、p-STAT1、Casepase-3蛋白表達水平均較對照組顯著升高，并且細胞凋亡水平也顯著高于對照組。因此我們推測，長期大強度運動導致的腦缺血能引起大量細胞因子和生長因子的釋放，可能激活JAK1/STAT1信號通路，通過調節與凋亡相關蛋白Caspase-3等的轉錄與磷酸化和其他途徑參與了缺血性腦損傷的過程，發揮了其促凋亡作用。

3.3 益氣養血補腎方對細胞凋亡及JAK/STAT信號通路的影響

我國傳統的中醫藥注重辯證施治，在抗運動疲勞方面具有顯著的優勢。長期大強度運動引起的運動疲勞屬于中醫“勞倦”、“虛勞”的范疇。中醫理論認為，腎藏精，主骨、生髓，為先天之本，腦為髓海。勞則傷腎，因此長期大強度運動可致腎精不足，髓海空虛。氣血是人體最基本的生命物質，腦離不開氣血的溫煦、儒養。勞則耗傷氣血等精微物質，腎精不足不能化生氣血，都可導致氣血虧虛，腦失濡養，引起缺血性腦損傷等病理生理過程。由此可見，長期大強度運動后引起的腎精不足，氣血虧虛是運動疲勞的主要病因病機。為此，本研究選用復方中藥益氣養血補腎方進行干預，旨在探討該方對運動疲勞的神經生物學機制，從而為該方藥延緩或消除運動疲勞提供分子水平的理論依據。益氣養血補腎方由八珍湯和肉桂、補骨脂等14味中藥組成，共奏補腎益精、氣血雙補之效。

本研究結果表明，中藥組的細胞凋亡水平及p-JAK1、p-STAT1、Casepase-3蛋白表達水平較大強度運動組均顯著降低（P<0.05，P<0.01）。因此說明，復方中藥益氣養血補腎方可能通過抑制p-JAK1、p-STAT1和Casepase-3的過度表達發揮抗凋亡作用，從而減輕缺血性腦損傷，達到神經保護作用。

綜上所述，長期大強度運動導致的腦缺血可能引起p-JAK1、p-STAT1、Casepase-3的過度表達，激活JAK1/STAT1信號通路，并發揮促凋亡作用，說明JAK1/STAT1信號轉導途徑可能參與了腦缺血損傷后的病理生理過程，但JAK1/STAT1信號轉導途徑在長期大強度運動導致的腦缺血損傷中的具體作用機制尚未完全闡明，仍需進一步研究。復方中藥益氣養血補腎方可能通過抑制p-JAK1、p-STAT1和Casepase-3的過度表達發揮抗凋亡作用，減輕缺血性腦損傷，從而達到神經保護作用。

參考文獻：

[1] Rawlings J S，Rosler K M，Harrison D A.The JAK/STAT signaling pathway[J].J Cell Sci，2004，117：1281-1283.

[2] Bedford T G，Tipton C M，Wilson N C，et al.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures[J].J Appl Physiol，1979，47 （ 6 ） ：1278-1283.

[3] 吳春燕. 復方中藥對運動疲勞大鼠海馬BDNF及其受體TrkBmRNA和蛋白表達的影響[J].山東體育科技，2013，35（5）：70-74.

[4] Bedford T G，Tipton C M，Wilson N C，et al.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures[J].J Appl Physiol，1979，47 （ 6 ） ：1278-1283.

[5] Wisloff U，Helgerud J，Kemi O J，et al.Intensity-controlled treadmill running in rats： VO2 max and cardiac hypertrophy[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2001，280：1301-1310.

[6] Lueassen PJ，Vollmann-Honsdorf GK，GleisbergM，et al.Chronie Psyehosocial stress differentially affects apopotosis in hippocampal subregions and cortex of the adult tree shrew[J].Eur J Neurosci，2001，14：161-166.

[7] Green DR.Apoptotic pathways： paper wraps stone blunts scissors[J].Cell，2000，102：1-4.

[8] Mackenzie ET，Mcculloch J，Harper AM.Influence of endogenous no repinephrine on cerebral blood flow and metabolism[J].Am J Physiol，1976，231（2）：483-488.

[9] Kisseleva T，Bhattacharya S，Braunstein J，et al.Signaling through the JAK-STAT pathway： recentadvances and future challenges[J].Gene，2002，285（1）： 1-24.

[10] Schindle C，Shuai K，Prezioso VR，et al.Interferon-dependent phosphorylation of a latent cytoplasmic transcription factors[J].Science，1992，5071：809-813.

[11] West D A，Valentim LM，LythgoeM F，et al.MR image-guided investigation of regional signal transducers and activators of transcription-1 activation in a ratmodelof focal cerebral ischemia[J].Neuroscience，2004，127（2）： 333-9.

[12] 李文濤，張博愛，劉艷茹，等.慢性腦缺血對信號轉導和轉錄激活因子-1的表達[J].中國實用神經疾病雜志，2007，10（3）：82-83.

[13] Stephanou A，BrarB K，KnightR A，Latchman D S.Opposing actions of STAT-1 and STAT-3 on the Bcl-2 and Bcl-x promoters[J].CellDeath Differ，2000，7（3）： 329-330.

[14] Li X，Klaus JA，Zhang J，et al.Contributions of poly（ADP-ribose） polymerase-1 and -2 to nuclear translocation of apoptosis-inducing factor and injury from focal cerebral ischemia[J].Neurochem，2010，113（4）：1012-1022.

[15] Ford AL，Lee JM.Climbing STAIR towards clinical trials with a novel PARP-1 inhibitor for the treatment of ischemic stroke[J].J Brain Res，2011，sep2：1410：120-121