聯合金雀異黃素和TRAIL處理對SMMC—7721肝癌干細胞樣細胞凋亡的影響

李翀　唐純娜　賀更生

[摘要] 目的 腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）選擇性誘導腫瘤細胞凋亡，但是其誘導促生存反應導致耐藥。金雀異黃素抑制核因子-κB（NF-κB）活性。本文旨在探討金雀異黃素和TRAIL以及兩者合用誘導人肝細胞癌SMMC-7721細胞系肝癌干細胞樣細胞凋亡的作用。 方法 干細胞條件培養基超低粘附板培養SMMC-7721細胞獲得第3代腫瘤球形成細胞，作為肝癌干細胞樣細胞。金雀異黃素（10 μM）、TRAIL（10 ng/mL）及兩者聯合處理肝癌干細胞樣細胞72 h；免疫酶聯吸附試驗（ELISA）測定細胞組蛋白/DNA碎片；碘化丙啶（PI）染色流式細胞術分析細胞凋亡率；Western blot檢測細胞NF-κB（p65）蛋白表達水平。 結果 10 μM 金雀異黃素誘導肝癌干細胞樣細胞組蛋白/DNA碎片水平（100% vs 152%）和凋亡率[（2.71±0.64）% vs （5.14±0.76）%]適度增高（P<0.05）；10 ng/mL TRAIL對肝癌干細胞樣細胞組蛋白/DNA碎片水平（100% vs 110%）和凋亡率[（2.71±0.64）% vs （3.15±0.72）%]無明顯影響；10 μM 金雀異黃素預孵育1 h，聯合10 ng/mL TRAIL處理導致組蛋白/DNA碎片水平（100% vs 568%）和凋亡率[（2.71±0.64）% vs （17.3±1.27）%]顯著增高（P<0.05）。10 ng/mL TRAIL誘導肝癌干細胞樣細胞NF-κB（p65）蛋白表達，10 μM 金雀異黃素抑制NF-κB（p65）蛋白表達，聯合金雀異黃素與TRAIL有效降低NF-κB（p65）蛋白表達水平。 結論 金雀異黃素與TRAIL協同誘導肝癌干細胞樣細胞凋亡涉及NF-κB抑制。

[關鍵詞] 肝細胞癌；腫瘤干細胞；細胞凋亡；NF-κB

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）13-0023-03

[Abstract] Objective Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand （TRAIL） has been demonstrated that selectively induced cancer cells， but facilitated prosurvival response leading to resistance. It has been reported that genistein could inhibit nuclear factor-κB（NF-κB） exprotein and activaty. The purpose of this study was to examine the effects of genistein or TRAIL， or both on apoptosis of liver cancer stem-like cells（LCSLCs） derived from SMMC-7721 cell line. Methods The third passage sphere-forming cells（SFCs） derived from SMMC-7721 cell line which was also called LCSLCs were obtained though suspended culture in ultra-low adhesion plate with stem cell-conditioned medium. LCSLCs were treated with Genistein（10 μM） and TRAIL（10 ng/mL） alone or in combination for 72 h. Histone/DNA fragment was tested using enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. And apoptosis rate was detected by flow cytometry （FCM） with propidium iodide（PI） staining； the protein expression of NF-κB（p65） was analyzed by western blot. Results The level of histone/DNA fragment（100% vs 152.6%） and apoptosis rate[（2.71±0.64）% vs （5.14±0.76）%] was increased moderately by genistein（10 μM） in LCSLCs（P<0.05）， but TRAIL（10 ng/mL） has no effect on histone/DNA fragment level（100% vs 110%） and apoptosis rate[（2.71±0.64）% vs （3.15±0.72）%]. After preincubation with 10μM genistein for 1h， the combination with 10 ng/mL TRAIL lead to significantly increase of histone/DNA fragment level（100% vs 568%） and apoptosis rate[（2.71±0.64）% vs （17.3±1.27）%] （P<0.05）. 10 ng/mL TRAIL induced NF-κB（p65） expression in LCSLCs. 10 μM genistein could suppress the protein expression of NF-κB（p65）. And the protein expression of NF-κB（p65） was significantly attenuated by the combination of genistein and TRAIL. Conclusion The apoptosis of LCSLCs which is co-induced by genistein and TRAIL is associated with the inhibition of NF-κB.

[Key words] Liver cancer； Cancer stem cell； Apoptosis； NF-κB

肝細胞癌位列癌癥相關死因第三位；其死亡率高主要是由于高復發率和耐藥性[1]。腫瘤干細胞理論認為腫瘤組織中存在化療抵抗的干細胞樣細胞群，在肝細胞癌中，肝癌干細胞能在化療后重新構建腫瘤[2]。腫瘤壞死因子相關凋亡配體（tumor necrosis factor-related apoptosis ligand，TRAIL）已經達到只針對惡性轉化細胞和不影響正常細胞和不損傷正常組織的治療結果。雖然Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗已經證明重組可溶性TRAIL有良好耐受性，但是其抗腫瘤活性有限[3]；此外，TRAIL信號并不總是導致癌細胞凋亡。事實上一些研究表明，TRAIL可以通過某些信號分子包括核因子-κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Akt等因子誘導促生存反應[3]。有研究顯示膠質母細胞瘤干細胞具有TRAIL抗性[4]。

金雀異黃素是大豆制品中的主要異黃酮。已有研究證明金雀異黃素在體內外具有預防和治療包括肝細胞癌在內的多種腫瘤作用[5]。還有研究表明，金雀異黃素通過抑制NF-κB活性增強腫瘤細胞的化療敏感性[6]。然而金雀異黃素是否能通過抑制NF-κB活性增強TRAIL誘導肝細胞癌干細胞樣細胞凋亡仍然缺乏文獻資料。本文研究金雀異黃素和TRAIL以及兩者合用對人肝細胞癌SMMC-7721細胞系肝癌干細胞樣細胞凋亡的作用，并探討其作用機制是否涉及金雀異黃素抑制基礎和TRAIL誘導NF-κB活性。

1 材料與方法

1.1細胞培養與試劑

人肝細胞癌細胞系SMMC-7721自上海中國科學院細胞庫（中國上海）購得。SMMC-7721細胞系生長用添加10%胎牛血清、100 IU/mL盤尼西林、100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養基置5% CO2、37℃的培養箱培養。

金雀異黃素和胰島素購自美國Sigma公司。重組人TRAIL購自美國R&D Systems 公司。高糖DMEM培養基、DMEM/F12培養基、50×B27添加物（不含維生素A）和胎牛血清購于美國Gibco公司。重組人表皮生長因子（EGF）和人堿性成纖維生長因子（bFGF）購于PROSPEC公司。鼠抗人NF-κB（p65）單克隆抗體購于美國Cell signaling公司；鼠抗人β-catenin單克隆抗體和辣根過氧化物酶結合的羊抗鼠二抗均購自美國Santa Cruz生物科技有限公司。

1.2腫瘤球培養

參照文獻[7]描述的方法，用無血清干細胞培養基[含20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、1×B27和0.4 μg/mL胰島素的DMEM/F12（Gibco Invitrogen）培養基]懸浮，以5000細胞/孔的密度接種6孔超低粘附培養板。培養6 d，得到腫瘤球形成細胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，并計數。

1.3細胞凋亡檢測

按照文獻[8]描述的方法，用碘化丙啶熒光染色流式細胞術測定細胞凋亡率以及酶聯免疫吸附法測定細胞組蛋白/DNA碎片水平評估細胞凋亡程度。

1.4蛋白印跡分析

按照文獻[8]描述的方法進行總細胞溶解產物的制備和蛋白印跡分析。抗DR5抗體、抗NF-κB（p65）抗體和抗β-actin抗體作為一抗。用增強型ECL蛋白質印記分析系統檢測信號。

2結果

2.1肝癌干細胞樣細胞的培養和擴增

干細胞條件培養基超低粘附板培養人肝細胞癌SMMC-7721細胞系細胞形成懸浮生長的腫瘤球（圖1）。腫瘤球傳代培養結果證實：第3代球形成細胞的腫瘤球形成率最高（18.92±2.17）%，作為后續實驗研究的肝癌干細胞樣細胞模型。

2.2金雀異黃素和TRAIL及兩者合用對肝癌干細胞樣細胞組蛋白/DNA碎片水平的影響

ELISA測定結果顯示：金雀異黃素（10 μM）處理導致肝癌干細胞樣細胞組蛋白/DNA碎片水平增高52%（P<0.05）；TRAIL（10 ng/mL）處理僅提高10%，差異無統計學意義；金雀異黃素（10 μM）與TRAIL（10 ng/mL）合用使組蛋白/DNA碎片水平增高468%，提示聯合金雀異黃素（10 μM）與TRAIL（10 ng/mL）協同性誘導肝癌干細胞樣細胞凋亡。見圖2。

2.3金雀異黃素和TRAIL及兩者合用對肝癌干細胞樣細胞凋亡率的影響

PI染色流式細胞術分析結果證實：溶媒（0.1% DMSO）處理、金雀異黃素（10 μM）處理、TRAIL（10 ng/mL）處理以及聯合金雀異黃素（10 μM）和TRAIL（10 ng/mL）處理肝癌干細胞樣細胞凋亡率分別是（2.71±0.64）%、（5.14±0.76）%、（3.15±0.72）%和（17.3±1.27）%（圖3），說明聯合金雀異黃素與TRAIL協同性誘導肝癌干細胞樣細胞凋亡。

2.4 聯合金雀異黃素與TRAIL下調NF-κB（p65）蛋白表達

Western blot分析結果表明，10 ng/mL TRAIL誘導肝癌干細胞樣細胞NF-κB（p65）蛋白表達，10 μM 金雀異黃素抑制NF-κB（p65）蛋白表達，聯合金雀異黃素與TRAIL有效降低NF-κB（p65）蛋白表達水平（圖4）。

3討論

盡管TRAIL具有選擇性腫瘤細胞毒性，不影響非惡性轉化細胞，可作為一種很有前途的抗癌藥物[9]；但是，我們的實驗結果發現，TRAIL（10 ng/mL）處理SMMC-7721細胞系球形成細胞即定義的肝癌干細胞樣細胞不能有效誘導細胞凋亡；其證據包括不能有效增高細胞組蛋白/DNA碎片水平和細胞凋亡率。這些結果提供了肝癌干細胞樣細胞具有TRAIL誘導細胞凋亡耐受性的證據。我們還證實TRAIL （10 ng/mL）處理誘導NF-κB（p65）蛋白表達，從而提示，肝癌干細胞樣細胞產生TRAIL誘導細胞凋亡耐受性的可能機制之一是其誘導NF-κB所致。

雖然金雀異黃素（10 μM）只能輕微誘導肝癌干細胞樣細胞凋亡，然而，當使用金雀異黃素（10 μM）預孵育后聯合TRAIL（10 ng/mL）處理導致肝癌干細胞樣細胞組蛋白/DNA碎片水平和細胞凋亡率增高數倍。這些結果證明，聯合金雀異黃素和TRAIL可以引起協同性誘導肝癌干細胞樣細胞凋亡作用，因此，有可能根除肝癌干細胞樣細胞，進而發揮治療人肝細胞癌作用。我們的結果顯示，金雀異黃素不僅能下調基礎NF-κB（p65）蛋白表達，而且能有效抑制TRAIL誘導的NF-κB（p65）蛋白表達。這些結果啟迪我們，金雀異黃素可能通過抑制TRAIL誘導NF-κB（p65）蛋白表達即NF-κB活化增強TRAIL誘導肝癌干細胞樣細胞凋亡作用。因此，我們的研究結果為臨床應用天然制劑金雀異黃素和選擇性腫瘤細胞凋亡誘導劑TRAIL靶向腫瘤干細胞治療腫瘤特別是肝細胞癌提供了合理性的解釋。

[參考文獻]

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（收稿日期：2015-03-05）