生脈飲復方制劑對病毒性心肌炎細胞凋亡作用的研究

熊麗輝+孫大中

doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2014.22.3

摘要目的：研究生脈飲對病毒性心肌炎心肌細胞凋亡作用的影響。方法：用柯薩奇B病毒建立感染的心肌細胞模型，在感染后24小時將細胞分為正常對照組、病理模型組、生脈飲組和輔酶Q10組。4組分別在不同時間點觀察細胞形態，并采用TUNEL法進行細胞凋亡的檢測。結果：在48小時點開始檢測，正常對照組無細胞凋亡，生脈飲組及輔酶Q10組均有凋亡，生脈飲組凋亡率低于輔酶Q10組（P<0.05），病理模型組隨著時間的推移，凋亡率增加，72小時點明顯高于48小時點（P<0.01），與藥物干預組比較差異具有統計學意義（P<0.05）。結論：生脈飲能夠有效抑制病毒性心肌炎心肌細胞的凋亡，且應該早期干預。

關鍵詞生脈飲；病毒性心肌炎；細胞凋亡

Study on the apoptosis effect of pulse-activating decoction compound preparation in viral myocarditis

Xiong Lihui1，Sun Dashan2

Basic Medical Colleg，Changchun Traditional Chinese Medicine University，1301171

2012 Grade Traditional Chinese medicine Professional Experimental Class，Guangzhou Traditional Chinese Medicine University（Guangzhou City，Guangdong），1301172

AbstractObjective：To study the effect of pulse-activating decoction compound preparation in myocardial apoptosis effect of viral myocarditis.Methods：Using coxsackie B virus established infectious myocardial cell model.In 24 hours after infection，the cells were divided into four groups：the normal control group，the pathological model group，the pulse-activating decoction group and the coenzyme Q10 group.The cellular morphology of four groups of cells were observed at different time points.The apoptosis was detected by TUNEL method.Results：Begin testing at 48 hours，the normal control group had no apoptosis；the pulse-activating decoction group and the coenzyme Q10 group all had apoptosis；the apoptosis rate of the pulse-activating decoction group was lower than that of the coenzyme Q10 group（P<0.05）.In the pathological model group，the apoptosis rate was increased as time goes on.72 hours point was obviously higher than 48 hours point（P<0.01）.There had statistically significant compared with the drug intervention group （P<0.05）.Conclusion：Pulse-activating decoction can effectively inhibit the myocardial cell apoptosis of viral myocarditis，and it should be early intervented.

Key wordsPulse-activating decoction；Viral myocarditis；Apoptosis

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VM）是指病毒感染引起的心肌局限性或彌漫性的急慢性炎性病變，多由柯薩奇病毒引起。在柯薩奇病毒導致VM的病理機制研究中，越來越多的證據表明，柯薩奇病毒導致病毒性心肌炎心肌細胞凋亡，從而出現心肌壞死病變[1]。中醫學認為VM屬于“心悸”“怔忡”范疇，病機中多存在氣陰兩虛，治療上以益氣養陰為主，多采用生脈飲進行加減治療，其組成為人參、麥冬、五味子。生脈飲治療VM臨床療效確切，但其干預機制尚不明確，且臨床上生脈飲是否應該早期應用一直是臨床爭議的問題。為此，本實驗擬觀察生脈飲對VM心肌細胞凋亡的影響，力求明確生脈飲的作用機制以及最佳時間，為臨床準確使用提供參考。

資料與方法

材料：①實驗動物：新生SD（Sprague-Dawlay）大鼠，1～3日齡，由吉林大學基礎醫學院動物實驗中心提供。②病毒株：柯薩奇B病毒試劑盒（Coxsackie Virus B3）。③實驗藥物：生脈飲注射液，輔酶Q10注射液，胰蛋白酶（1：250），Sigma；DMEM（dulbecs modified eagle）培養基，GIBCO；胎牛血清，GIBCO；牛血清白蛋白，GIBCO。④溶液配制：緩沖液：Na2HPO4·2H2O 0.06 g，KH2PO4 0.06 g，MgSO4·7H2O 0.20 g，葡萄糖1.00 g，NaCl 8.00 g，KCl 4 g，CaCl2 0.14 g，三蒸水1 000 mL。DMEM培養液：20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素及谷氨酰胺。細胞消化液：由Ⅰ型膠原酶20 mg、胰蛋白酶18 mg、牛血清白蛋白10 mg、加Eagle培養基10 mL。

方法：①心室肌細胞培養：大鼠打開胸腔，取出心室肌，放入緩沖液中洗滌，剪取心室肌組織經胰酶37℃水浴消化10分鐘后，1000 rpm離心，反復數次，收集沉淀的細胞。按照細胞懸液5×106/mL密度種植于96孔板，置于37℃5%CO2培養箱中培養。②CVB3感染心室肌細胞：大約72小時后，光鏡下觀察細胞已貼壁，將CVB3病毒株作連續10倍稀釋，接種于96孔板心室肌細胞，1小時后，棄去病毒液，加入培養液。③生脈飲干預：病毒感染24小時后，分別加入藥物進行干預。生脈飲干預組：每天加生脈飲、100TCID50CVB3、DMEM后繼續培養；輔酶Q10組：每天加輔酶Q10、100TCID50CVB3、DMEM后繼續培養；病理模型組：每天加100TCID50CVB3 + DMEM；正常對照組：常規細胞液培養。④心肌細胞形態觀察：心肌細胞采用蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下在不同時間點觀察每組細胞形態，尤其注意觀察細胞壞死及細胞凋亡情況。⑤心肌細胞存活率的檢測：MTT（用PBS將MTT配成5 mg/mL溶液）比色法測定細胞存活率。⑥心肌細胞凋亡率的檢測：采用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）對細胞凋亡進行檢測。將細胞預處理后，按照試劑盒說明進行操作。染色后，正常心肌細胞核呈藍色，凋亡心肌細胞核呈現棕黃色，在光學顯微鏡下計數。方法是隨機選擇5個高倍視野（40×10），計算每個視野陽性心肌細胞數的比例，取平均值，計算心肌細胞凋亡百分率。

統計學處理：采用SPSS 18.0統計學軟件，用t檢驗進行各數值之間的分析比較。

結果

細胞形態：細胞培養大約72小時后，顯微鏡下觀察，心肌細胞成簇分布，并規律成片搏動，表明心肌細胞培養成功。病毒接種后24小時，細胞形態開始出現變化，逐漸有扁縮，搏動減弱；48小時點，生脈飲干預組、輔酶Q10組、病理模型組細胞變扁縮情況增多，以病理模型組最為明顯；正常對照組細胞生長良好，數量進一步增多，滿布視野。72小時點，生脈飲干預組、輔酶Q10組、病理模型組開始出現細胞有脫落，病理模型組有明顯的細胞壞死；生脈飲干預組、輔酶Q10組細胞壞死不明顯，生脈飲組細胞形態較24小時點有所恢復；正常對照組細胞生長良好，數量無增加。

細胞存活率：在72小時點，正常組細胞存活率100%。病理對照組隨著時間的延長，存活率明顯下降，72小時點存活率不足50%；生脈飲干預組存活率仍>75%，輔酶Q10組細胞存活率明顯下降，大約60%。

細胞凋亡率，見表1。

討論

細胞凋亡是指機體細胞在發育過程中，由于受到某些因素的影響，通過細胞內基因及其產物的調控而發生的一種程序性細胞死亡。細胞凋亡參與了體內多種病理過程，與疾病的發生有著密切的關系，亦與病毒性心肌炎的發生相關[2]。CVB3病毒感染心肌后，導致心肌細胞凋亡，引起心肌細胞病變，進而形成心功能障礙[3]。

本研究從細胞形態、存活率及細胞凋亡3個方面進行了實驗，結果表明，柯薩奇病毒B導致心肌細胞變形、壞死，并逐步發生細胞凋亡。病理模型組，隨著時間的推移，凋亡發生增加，而正常對照組在72小時未發現凋亡細胞。生脈飲主要成分為人參、麥冬和五味子，具有調節機體免疫的作用，藥理研究表明具有抗氧化的能力，保護心肌細胞的超微結構，從而發揮了對心肌細胞的保護作用。由于生脈飲的免疫調節機制，我們認為早期應用生脈飲效果更佳，實驗研究發現，在感染后24小時用生脈飲對感染的心肌細胞進行干預，在48小時點凋亡的減少不明顯，而72小時則減少明顯，說明免疫調節的發生需要一定的時間。臨床應早期使用生脈飲為佳。

參考文獻

[1]黎帆，余克花，莫冰，等.川芎嗪對CVB3感染小鼠心肌細胞凋亡的影響[J].南昌大學學報（醫學版），2010，50（4）：14-16.

[2]曹蕾，林佳，王瑧，等.雷公藤甲素對病毒性心肌炎細胞凋亡及Fas/FasL蛋白表達的研究[J].現代生物醫學進展，2012，（9）： 1636-1638.

[3]Yin XC，Peng YH，Xiao ZX.Mechanism of Fas/FasL signal transduction pathway in K562 cell apoptosis induced by diallyl disulfide[J].Journal of Experimental Hematology， 2011，19（3）：634-637.