白色念珠菌對人口腔黏膜上皮角質細胞的作用研究

張輝+俞誠波+張蓓蓓+葉美華+蔡敏秋+許紅苗+林敏麗

[摘要] 目的 研究白色念珠菌對人口腔黏膜上皮角質細胞的作用機制。 方法 將培養的口腔黏膜上皮角質細胞分別加入孢子型白色念珠菌（孢子組）和菌絲型白色念珠菌（菌絲組），另將單獨培養的口腔黏膜上皮角質細胞作為陰性對照組。比較各組對口腔黏膜上皮角質細胞的黏附作用，并觀察白色念珠菌對口腔黏膜上皮角質細胞的凋亡和增殖作用。 結果 菌絲組黏附指數（7.63±1.39）顯著高于孢子組（3.47±1.04），差異有統計學意義（P < 0.05）;菌絲組凋亡率[（3.49±0.4）%]顯著高于孢子組[（2.07±0.15）%]和陰性對照組[（1.98±0.07）%]，差異有統計學意義（P < 0.05），而孢子組和陰性對照組凋亡率相比差異無統計學意義（P > 0.05）。菌絲組G0/G1期細胞比例[（38.17±7.83）%]顯著低于孢子組[（49.47±11.41）%]和陰性對照組[（57.71±9.39）%]，差異有統計學意義（P < 0.05）;S期[（8.54±4.03）%]、G2/M期[（20.18±9.59）%]細胞比例上升，且顯著高于孢子組[（6.47±2.73）%、（10.71±3.19）%]和陰性對照組[（5.35±2.11）%、（12.38±4.35）%]，差異有統計學意義（P < 0.05）;PI[（42.79±18.73）%]明顯高于孢子組[（28.67±8.79）%]和陰性對照組[（26.87±7.64）%]，差異有統計學意義（P < 0.05），而孢子組和陰性對照組PI相比差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 白色念珠菌能夠導致口腔黏膜上皮角質細胞發生凋亡和增殖周期改變。

[關鍵詞] 白色念珠菌;人口腔黏膜上皮角質細胞;細胞凋亡;細胞周期

[中圖分類號] R781.5 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2015）01（a）-0004-04

Study on the mechanism of Candida albicans on human buccal epithelial cells

ZHANG Hui ? YU Chengbo ? ZHANG Beibei ? YE Meihua ? CAI Minqiu ? XU Hongmiao ? LIN Minli

Department of Stomatology， Wenling Hospital Affiliated to Wenzhou Medical College， Zhejiang Province， Wenzhou ? 317500， China

[Abstract] Objective To explore the mechanism of Candida albicans on human buccal epithelial cells. Methods The oral mucosa keratinocyte cultures were added to spore type of Candida albicans （spores group） and hyphae of Candida albicans （mycelium group）， oral mucosal epithelial cells cultured alone as negative control group. Compared adhesion effect of oral mucosal epithelial cells in each group， and observed the apoptosis and proliferation of Candida albicans to buccal epithelial cells. Results Adhesion index of mycelium group （7.63±1.39） was significantly higher than spore group （3.47±1.04）， with statistically significant difference （P < 0.05）; the apoptosis rate [（3.49±0.4）%] was significantly higher than that in spores group [（2.07±0.15）%] and the control group [（1.98±0.07）%]， with statistically significant difference （P < 0.05）， while the spores group and the control group had no significant difference （P > 0.05）. The proportion of phase G0/G1 in mycelium group [（38.17±7.83）%] was significantly lower than that of spore group [（49.47±11.41）%] and the control group [（57.71±9.39）%]， with statistically significant difference （P < 0.05）; the proportion of phase S [（8.54±4.03）%] and phase G2/M [（20.18±9.59）%] increased， significantly higher than those of the spores group [（6.47±2.73）%， （10.71±3.19）%] and the control group [（5.35±2.11）%， （12.38±4.35）%]， with statistically significant difference （P < 0.05）; PI [（42.79±18.73）%] was significantly higher than spore group [（28.67±8.79）%] and the control group [（26.87±7.64）%] ， with statistically significant difference （P < 0.05）， while the spores group and the control group had no significant difference （P > 0.05）. Conclusion Candida albicans can cause oral mucosa keratinocyte apoptosis and proliferation cycle change.

[Key words] Candida albicans; Human oral mucosal epithelial cells; Apoptosis; Cell cycle

白色念珠菌（Canidia albicans）是一種常見的條件致病菌[1-2]，正常情況下白色念珠菌不引起疾病，與機體共生，機體發生白色念珠菌感染的主要原因是正常的防御功能受到損害。白色念珠菌普遍存在于人體中，調查顯示[3]，口腔中白色念珠菌帶菌率最高，約為85%。近年來大量廣譜抗生素以及免疫抑制劑的使用導致菌群失調和機體免疫力降低，使得非致病性白色念珠菌轉化為條件致病菌而引起各組織感染。研究顯示[4]，口腔白色念珠菌感染屬于慢性感染，難以徹底根治，且病情容易反復發作，給患者的日常生活造成嚴重影響。關于白色念珠菌的致病機制目前仍無明確結論，有報道稱[5]，黏附作用在白色念珠菌定植、侵襲中發揮著重要作用。口腔黏膜上皮角質細胞是口腔防御的主要物質基礎，也是白色念珠菌侵襲的主要靶細胞，但是白色念珠菌是如何侵襲口腔黏膜上皮角質細胞并產生致病作用，目前仍未見相關報道。本研究通過分析白色念珠菌對口腔黏膜上皮角質細胞的黏附作用以及對增殖和凋亡的影響，以期為豐富臨床治療提供理論基礎，現將研究成果報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白色念珠菌標準菌株（ATCC90029）購自南京便診生物科技有限公司，人口腔黏膜上皮角質細胞購自中國醫學科學院;沙堡（4%）葡萄糖瓊脂培養基（SDA）購自廣州市齊云生物技術有限公司;其他相關儀器和試劑均由溫州醫學院附屬溫嶺醫院實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 白色念珠菌培養 ?將ATCC90029白色念珠菌標準菌株培養于沙堡培養基中，轉種3次后配成菌懸液，濃度設定為3×105 CFU/mL。孢子型白色念珠菌：將白色念珠菌接種于酵母膏胨葡萄糖（YPD）培養基中37℃培養至長出白色乳狀菌落，將菌落再轉種于含YPD培養基的離心管中，37℃孵育18 h。菌絲型白色念珠菌：將白色念珠菌接種于pH 6.0、含10%磷酸鹽緩沖液（PBS）的RPMI 1640培養基中，37℃孵育3～5 h即誘導出菌絲型白色念珠菌。

1.2.2 口腔黏膜上皮角質細胞培養 ?常規細胞傳代培養，選擇對數生長期的角質細胞，用含0.02%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）的胰蛋白酶（0.25%）消化，將細胞收集并離心，棄去上清液，加入預先配置的凍存液，將細胞吹打混勻。-80℃保存待用。

1.2.3 實驗分組 ?口腔黏膜上皮角質細胞在培養瓶中培養48 h，將細胞貼壁制成單層細胞，棄去培養液后用PBS沖洗3次。將加入菌絲型白色念珠菌的作為菌絲組，加入孢子型白色念珠菌的作為孢子組，單獨培養的口腔黏膜上皮角質細胞作為陰性對照組。

1.2.4 黏附試驗 ?生長期口腔黏膜上皮角質細胞用胰蛋白酶消化，將孢子型、菌絲型白色念珠菌分別與口腔黏膜上皮角質細胞共同培養48 h，用濾膜收集口腔黏膜上皮角質細胞，再用PBS洗濾3次，收集懸液離心，并制成涂片;待風干后進行染色，電鏡下觀測黏附現象。隨機選擇100個口腔黏膜上皮角質細胞，統計白色念珠菌總數，并計算黏附指數。黏附指數=黏附白色念珠菌數量/細胞總數。所有實驗平行測量3次，取3次均值。

1.2.5 細胞凋亡檢測 ?生長期口腔黏膜上皮角質細胞用胰蛋白酶消化，將不同表型白色念珠菌加入培養瓶中感染，并于CO2培養箱中培養48 h，然后胰蛋白酶消化，再用PBS沖洗3次，離心棄上清液。加入10 μL異硫氰酸熒光素混勻，室溫避光反應20 min;再加入5 μL碘化丙啶后，采用流式細胞儀上機檢測，計算細胞凋亡率，并用軟件分析G0/G1期、S期、G2/M期細胞百分數。上述操作平行重復3次，取均值。增殖指數（PI）=[（S+G2/M）/G0/G1+S+G2/M]×100%。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組黏附指數與凋亡率比較

菌絲組黏附指數顯著高于孢子組（P < 0.05）;菌絲組凋亡率顯著高于孢子組和陰性對照組（P < 0.05），而孢子組和陰性對照組凋亡率相比差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

表1 ? 各組黏附指數與凋亡率比較（x±s）

注：與孢子組比較，aP < 0.05;與陰性對照組比較，bP < 0.05;“-”表示無數據

2.2 各組口腔黏膜上皮角質細胞周期比較

菌絲組G0/G1期細胞比例顯著低于孢子組和陰性對照組（P < 0.05），S期、G2/M期細胞比例上升，且顯著高于孢子組和陰性對照組（P < 0.05），PI明顯高于孢子組和陰性對照組（P < 0.05），孢子組和陰性對照組PI比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

表2 ? 各組口腔黏膜上皮角質細胞周期及增殖指數比較（%，x±s）

注：與孢子組比較，aP < 0.05;與陰性對照組比較，bP < 0.05

3 討論

口腔念珠菌感染是真菌-念珠菌屬感染所引起的口腔黏膜疾病[6]，又稱口腔念珠菌病。近年來，由于抗生素和免疫抑制劑在臨床上的廣泛應用，發生菌群失調或免疫力降低，使內臟、皮膚、黏膜被真菌感染者日益增多，口腔黏膜念珠菌病的發生率也相應增高[7-8]，其中，白色念珠菌是最主要的病原菌。鵝口瘡（雪口病）是最常見的口腔念珠菌病。25%～50%的健康人口腔、陰道、消化道可帶有念珠菌，但不發病;而非致病性念珠菌，在某種條件下，可轉化為致病性[9]，故有人稱念珠狀菌為條件致病菌。在幼兒雪口病、托牙性口炎、口角炎、念珠菌性白斑病和慢性黏膜皮膚念珠菌病患者中，白色念珠菌的檢出率分別為84%、69%、77%、84%和100%[10]。念珠菌毒性的強弱，取決于毒性物質的代謝產物。在消化道或陰道內寄生的酵母型念珠菌并無致病性，而當它發育為菌絲型時，才有致病性。白色念珠菌的毒素具有相當于病毒的磷脂酶-A型的活性[11]，以本菌的混懸液注入動物靜脈中可致死。因此，病原菌的毒性和類型，與疾病力有密切關系。在健康帶菌者中，唾液含菌量低于200 CFU/mL，因此，一般鏡檢法不能直接查見涂片中的病原體。白色念珠菌對口腔黏膜上皮有較強的黏附性，這是它致病作用的“立足點”，此種黏附性依靠上皮細胞表面的甘露糖苷蛋白部分[12]，作為細胞的表面受體而發揮其黏附作用。因此，可破壞糖苷蛋白或相似結構物抑制黏附的發生，這對探索新的治療藥物提供了方向。

角質細胞是上皮細胞的重要組成部分，它為機體抵御外界病原菌侵襲提供了一層機械性屏障。目前研究證實[13]，角質細胞是口腔黏膜損傷的靶細胞。Obokata等[14]研究中也提到，角質細胞是口腔黏膜上皮中含量最多的一種細胞，當發生白色念珠菌感染時，其也是主要侵襲靶細胞。白色念珠菌廣泛存在于人和動物中，正常條件下不會致病;但有多數研究顯示，白色念珠菌具有潛在致病性。Martinez等[15]證實，白色念珠菌感染疾病中，病變區上皮細胞明顯增厚，深層顯著增生，導致細胞有絲分裂加速，常伴有錯角化，因此推測白色念珠菌可以導致口腔黏膜出現白斑損害。但是白色念珠菌的具體作用機制目前還不清楚，有研究認為[16]，白色念珠菌致病性主要體現在侵襲能力，目前已知與侵襲能力相關的因素包括黏附性、疏水性和表型轉換等。黏附性是白色念珠菌侵襲的第一步，也是其強致病力的主要標志。江文俊等[17]研究發現，白色念珠菌主要存在芽生孢子和假菌絲兩種形式，也即孢子型和菌絲型，但是究竟何種類型的菌株具有致病性尚無統一定論。在本研究中，菌絲組黏附指數顯著高于孢子組，這與陽雋等[18]報道結論相同，說明菌絲型的黏附能力大于孢子型。也有學者發現[19]，白色念珠菌菌絲形成進一步促進黏附作用，而黏附也會加速菌絲形成。因此，可以初步推測，白色念珠菌菌絲的形成有利于提高黏附性。

細胞凋亡是清除細胞的正常途徑，若正常凋亡受到影響，將會促進細胞異常發育和腫瘤的產生。李燕等[20]研究顯示，隨著腫瘤生長的加速，細胞凋亡數量也隨之增加。曹婕等[21]對口腔黏膜上皮脫落碎片進行檢測后證實，口腔惡性腫瘤或癌前病變的唾液中存在明顯細胞凋亡情況，其凋亡與口腔白斑密切相關。高巖等[22]也發現，白斑癌變中，細胞凋亡參與了整個過程，且在不同過程作用各異，隨著上皮細胞增生的加重，凋亡呈指數上升。本次研究中菌絲組凋亡率顯著高于孢子組和陰性對照組，證實菌絲的產生促進細胞凋亡，這可能是白斑發生癌變的原因之一。

在細胞周期中，G1期是RNA和DNA聚合酶合成期，S期是DNA合成期。一般情況下，繁殖旺盛的細胞在S期、G2/M期比例較高。而PI則代表整個群體中細胞增殖的能力。為了進一步研究此過程，本研究對細胞不同分裂時期的細胞比例進行分析，結果顯示，菌絲組G0/G1期細胞比例顯著低于孢子組和陰性對照組，S期、G2/M期細胞比例顯著高于孢子組和陰性對照組，PI也隨之增加。說明菌絲型能夠促進口腔黏膜上皮角質細胞的增長，其機制可能是促進細胞由G1期向S期轉變，導致DNA合成加快，細胞增殖速度增加。此外本結果也提示白色念珠菌對口腔黏膜上皮角質細胞的增殖促進作用依賴于菌株的毒性作用和細胞的感染能力。目前多數專家達成的共識是：白色念珠菌中的毒性作用導致口腔黏膜上皮角質細胞中抑制增殖物質合成減少，使上皮細胞過度角質化，細胞出現異常增生，并可能發生癌變。本研究結論與上述觀點完全相符。當然白色念珠菌導致口腔癌變的機制較多，而本研究也只是初步探討了其癌變可能的機制之一，但是本實驗證實白色念珠菌的表型與口腔白斑和癌變密切相關，這需要引起臨床重視。

綜上所述，白色念珠菌能夠導致口腔黏膜上皮角質細胞發生凋亡和增殖周期改變，這種改變依賴于該菌的黏附性和感染性。

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（收稿日期：2014-08-26 ?本文編輯：程 ?銘）