鼻咽癌轉移相關分子標志物的研究進展

詹德超　余忠華

[摘要] 鼻咽癌是一種來源于鼻黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，是我國南方常見的惡性腫瘤之一。鼻咽癌大多數為低分化癌，惡性程度較高，易發生遠處轉移。國內外研究表明，腫瘤的侵襲和轉移與細胞的異常運動有關，是腫瘤細胞的粘附、降解、運動以及血管生成等多種生物學行為互相作用的動態過程。但是NPC浸潤轉移的分子機制至今尚未完全闡明。隨著現代分子生物學的發展，越來越多鼻咽癌轉移的相關分子標志物逐漸被發現。深入了解這些分子標志物的表達及調控，篩選出對鼻咽癌具有較高敏感性、特異性并可進行早期診斷及評估預后的標記物，尋找出藥物新靶點進行針對性更強的抗腫瘤治療具有十分重要的意義。本研究擬對鼻咽癌轉移相關分子標志物的研究進展做一綜述。

[關鍵詞] 鼻咽癌；轉移；分子標志物

[中圖分類號] R739.63 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）13-0147-06

[Abstract] Nasopharyngeal carcinoma is a malignant neoplasm which arises from the mucosal epithelium cells of the nasopharynx，it is also one of the common malignant tumors in southern China. Most nasopharyngeal carcinomas are poorly differentiated carcinomas. Nasopharyngeal carcinomas are high degree of malignancy，which prone to distant metastasis.The invasion and metastasis of neoplasm are associated with the perverted movement of cells，which is a dynamic process of biologic behavior interactions among adhesion，degradation and angiogenesis in cancer cells. However， the molecular mechanisms underlying NPC invasion and metastasis have not fully elucidated. With the development of Modem molecular biology，more and more new molecular markers in NPC，such as biomarkers have been gotten to know the related molecules expression and molecular regulation， which play important roles in screening tumor markers with more high sensitivity and specificity，achieving early diagnosis ，predicting treatment prognoses and providing new therapeutic strategies to make it more pertinent in anti-tumor therapy. This study is aimed to review the research progress of molecular marker in metastasis of nasopharyngeal carcinoma.

[Key words] Nasopharyngeal carcinoma；Metastasis；Molecular marker

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）大多數為低分化癌，惡性程度較高，易發生遠處轉移，是患者治療失敗和死亡的主要原因。鼻咽癌轉移是一個多因素、多步驟相互作用的過程，涉及多種基因及其產物的相互作用，目前機制尚未完全闡明。本文就鼻咽癌轉移相關分子標志物的研究進展做一綜述。

1 EBV

1.1 結構與功能

EB病毒（eostein barr virus，EBV）是1964年Eostein和Barr在研究非洲兒童的惡性淋巴瘤時，從瘤細胞培養中發現的1種嗜人類B淋巴細胞的皰疹病毒，屬于γ亞科。EB病毒是一種線狀雙鏈DNA病毒，由很多種不同的重復序列構成。在鼻咽癌患者體內，EB病毒主要表達EBER EBV核抗原1基因（EBNA-1）、潛伏膜蛋白基因（LMP-1和LMP-2）[1]。多倫多大學的實驗已經證實，EBER EBV核抗原1基因能夠促使細胞“永生不死”引起腫瘤細胞不斷生長從而導致人體患上某種癌癥的分子事件。該研究闡述了EBNA-1通過和細胞中的特殊蛋白結合，繼而干擾天然細胞生長調節、導致細胞不斷生長、提高癌變幾率的分子機制[2]。潛伏膜蛋白基因1在EBV潛伏感染過程中表達，現在不但被確定是唯一具有癌基因編碼蛋白特點的EBV基因產物，能夠促進細胞癌變和轉移，而且是唯一可在體外轉化細胞的EBV編碼的基因產物，可明顯增強EBV介導的B淋巴細胞增殖和永生化[1]。潛伏膜蛋白基因1是一種由386個氨基酸（aa）殘基組成的跨膜蛋白，包括3個結構域：①親水性氨基端胞漿區（l～23 aa）；②疏水性跨膜區（24～186aa）；③親水性羧基端胞漿區（187～386aa）。有研究表明潛伏膜蛋白基因1主要通過三個不同羧基端功能區發揮作用[3]：一個是位于194～231位氨基酸殘基的CTAR1；另一個是位于352～386位氨基酸殘基的CTAR2；第三個是275～307位氨基酸殘基構成的CTAR3。

1.2 與鼻咽癌轉移的關系

EBV編碼基因參與免疫逃避和多種信號通路的調節，與鼻咽癌的轉移密切相關。潛伏膜蛋白基因1是EBV基因組中發現的第一個能改變細胞形態的癌基因，是誘導侵襲轉移的主要因素，通過活化NF-κB、AP-1、JAK/STAT、PI-PLC-PKC等細胞內信號通路，促進細胞轉化，從而導致腫瘤細胞具有很強的侵襲和轉移能力[4]。Krishna等[5]實驗證明，較高濃度EBV感染的鼻咽癌組中VEGF表達較高，提示EBV感染可以使VEGF的表達升高，從而使NPC血管生成增加。Horikawa T等[6]研究表明EBV-LMP1誘導Twist表達增加，促進鼻咽上皮細胞發生上皮-間質轉化，同步引起E-Cadherin的下降，導致細胞形態、粘附能力變化，從而使其侵襲和轉移能力增加。李剛等[7]研究表明潛伏膜蛋白基因1通過增加貼壁生長、基膜穿透以及細胞移動能力等，進一步促進NPC細胞轉移。EBNA1通過與USP7結合和抑制其與p53蛋白的反應來干擾天然細胞調節過程。我們知道其他所有能刺激細胞擴增的病毒均是直接作用于p53導致癌變的，但實驗證明EBV是通過影響p53的調節來致癌的[1]。LMP-2有關NPC轉移的報道較少。EBV靶向治療是一種新的針對性更強的治療方法，通過提高對EBNA1和LMP1、2抗原的細胞免疫以及誘導癌細胞溶解來治療鼻咽癌。目前一期臨床研究已經有大量數據表明EBV靶向治療對疾病轉歸是安全有效的[8]。

EBV血清學檢測是NPC篩查的常規方法，但EBV抗體檢測的特異性差，陽性預測值低，對臨床診治意義不大[9]。但是由于EBV-DNA來源于整合了EBV的鼻咽癌細胞，血漿EBV-DNA定量檢測對NPC的臨床診治可謂前景廣闊。目前國內外文獻認為鼻咽癌患者的分期、預后與EBV水平密切相關，濃度越高，分期越晚，預后越差。血漿中的EBV-DNA濃度可以反映腫瘤的增長和消失，能初步篩選出鼻咽癌殘留和復發的患者，是一個敏感性較高的標志物[10]。國內侯雪等[11]分別檢測69例初治鼻咽癌患者治療前、后血漿EBV-DNA水平，研究表明EBV-DNA水平能夠預測鼻咽癌有無遠處轉移。Leung等[12]的研究表明，對于Ⅰ、Ⅱ期的鼻咽癌患者，治療前血漿EBV-DNA水平>4000 copy/mL，其遠處轉移幾率遠高于<4000 copy/mL者，兩組數據比較差異具有統計學意義。治療前鼻咽癌復發患者的血漿中EBV-DNA水平明顯高于不復發的病例，治療后評估為臨床完全緩解的患者血漿中EBV-DNA水平非常低下甚至測不到。治療前血漿中EBV-DNA水平<1500 copy/mL患者的無復發生存率遠低于濃度>1500 copy/mL的無復發生存率[1]。假如將NPC和鼻咽部其他腫瘤進行鑒別時，EBV血清學濃度檢測可以幫助初步診斷。有研究表明頸部淋巴結出現轉移癌，當EBV血清學濃度檢測呈陽性時，提示原發腫瘤很可能是鼻咽癌[1]。總之，血漿EBV-DNA定量檢測作為一種非侵入性檢測方法，對鼻咽癌早期診斷、評估療效、預測有無復發、遠處轉移很有意義，并且可行性大，患者容易接受。

在臨床工作中，發現部分鼻咽癌未轉移前的患者EBV-DNA水平甚至比轉移后更高，其原因可能是：①有的微轉移灶治療前已經轉移到血液系統中，但是由于現在的檢驗學、影像學等檢查水平的限制，無法檢查出來；②經過抗腫瘤治療后EBV-DNA水平明顯下降。另外部分鼻咽癌患者在放化療綜合治療后，還可檢測出較高水平的EBV-DNA，原因可能是有的醫師過于擔心化療藥物或放療副作用會影響到患者生活質量，使用的藥物劑量比較保守，或放療處方劑量未達標，導致少量微轉移灶沒有被完全殺滅掉。

2 VEGF

2.1 結構與功能

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），早期稱為血管通透因子（vascular perm eability factor，VPF），能在體內誘導新的血管形成。1989年有研究人員在牛垂體星形膠質細胞體外培養時發現VEGF，通過克隆與基因測序，證實VPF和VEGF是相同基因編碼的同一種蛋白。VEGF基因位于6p21.3，全長為14kb。VEGF基因由8個外顯子和7個內含子構成，共有A、B、C、D、E 5種亞型。VEGF家族全部成員均可與細胞表面酪氨酸激酶受體結合，構成異二聚體，促使酪氨酸磷酸化，從而激活RAS-RAF-MEK-ERK和PI3信號通路，使轉錄因子激活或mRNA降解，進一步促進血管生成。VEGF-A具有促使內皮細胞加速有絲分裂、遷移的功能；VEGF-B主要促使胚胎血管的形成；VEGF-C、D可使淋巴管的形成加速[13]。

2.2 與鼻咽癌轉移的關系

1990年，美國哈佛大學Folkman博士提出著名的Folkman理論[14]：腫瘤組織的生長，需要依靠新生血管的生成來供應足夠的氧氣和營養物質來維持。我們知道新生血管是實體瘤生長、侵襲和轉移的基礎，血管內皮生長因子是迄今為止發現的唯一能夠特異地在血管內皮細胞作用的因子，有望廣泛應用于臨床。VEGF在大部分惡性腫瘤中都呈高表達[15]，但其機制不清。癌癥患者微血管密度數量越高，預后越差。研究證實NPC的發生、發展也有血管生成依賴性。VEGF可以使腫瘤血管的形成加速，在惡性腫瘤的生長、浸潤、轉移過程中具有十分重要的作用。駱梅青等[13]研究表明癌組織中的微淋巴管密度與VEGF-C、VEGFR-3的表達顯著相關（P<0.01），證實VEGF-C與VEGFR-3的結合能夠加速淋巴管的形成，為惡性腫瘤淋巴轉移創造有利條件。Qian等[16]通過測量NPC轉移組、未轉移組、健康人群的VEGF-C水平，實驗證實VEGF-C與NPC轉移呈正相關，與局部浸潤無關；國內李欽等[17]實驗表明，VEGF-C在鼻咽癌組織中陽性表達率為77.5%，并且VEGF-C陽性表達在淋巴結轉移組明顯高于無淋巴結轉移組，在鼻咽正常黏膜組中呈弱表達。由此可見VEGF有望作為初步診斷NPC有無淋巴結轉移、評估預后的分子標志物。

宋向芹等[18]實驗證實VEGF基因沉默能夠影響細胞的侵襲和遷移。蔡鑫章等[19]通過體內實驗證實對VEGF進行基因沉默能夠抑制實體腫瘤的生長。利用基因沉默技術進行惡性腫瘤靶向治療已成為當今科研的熱點。目前已開發出抑制VEGF抗腫瘤藥物[20]，如阿瓦斯汀、恩度等，但藥物尚處于試驗階段，加上藥物昂貴，臨床上患者未能廣泛使用。

3 MMP

3.1 結構與功能

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）屬于鋅蛋白酶超家族成員，1962年Woessner在哺乳動物子宮內發現能夠降解膠原的第一個MMP，現已發現26個成員，能夠降解細胞外基質（ECM），并與金屬蛋白酶抑制劑（TMP）共同調節ECM的動態平衡及基膜的完整性。依據作用底物和片段同源性[21]，基質金屬蛋白酶可分為8類，分別為膠原酶（MMP-la、lb、8、13、18）、明膠酶（MMP-2、9）、間質溶解素（MMP-3、10、11）、基質溶解素（MMP-7、26 ）、金屬彈性蛋白酶（MMP-12）、膜型金屬基質蛋白酶（MMP-14、15、16、17、24、25）、釉質溶解素（MMP20）以及分泌型MMP（MMP-19、21、23A、23B、27、28）。研究證明MMP-2和MMP-9可以降解Ⅳ型膠原，從而促進細胞轉移。MMP-2和MMP-9是發現的與腫瘤侵襲和轉移最密切相關[22]，研究也最為透切的。MMP-2、MMP-9呈高表達已然成為腫瘤浸潤和轉移的先決條件[23]。研究表明[24]，MMP-2不但能夠降解ECM，而且降解非ECM，能明顯抑制腫瘤細胞的凋亡；MMP-9不但能降解蛋白聚糖等多種底物，而且能夠降解VEGF，加速血管生長，促進癌細胞的轉移。

3.2 與鼻咽癌轉移的關系

惡性腫瘤轉移時，細胞外基質（ECM）和基底膜是腫瘤生長、擴散的自然屏障。腫瘤細胞對ECM的降解是腫瘤侵襲、轉移過程的一個關鍵節點，通過激活蛋白酶引起細胞外基質酶的降解發揮作用。國內外文獻表明基質金屬蛋白酶與金屬蛋白酶抑制劑生成水平與激活程度的失衡是腫瘤侵襲、轉移的關鍵因素，MMP-2/TMP-2、 MMP-9 /TMP-1的比例失衡與腫瘤侵襲、轉移關系最為重要。熊丹寧等[25]利用實驗證實MMP-9的活性高低與淋巴結轉移潛能呈正相關。羅國慶等[26]研究表明，不但NPC組織中MMP-2和MMP-9的陽性率遠高于正常對照組（P<0.05），而且淋巴結轉移組陽性率遠高于無淋巴結轉移組（P<0.05）。研究報道[27]，NPC中MMP-9的陽性表達率為83.87%，癌旁組織中為35.56%，且腫瘤越大、轉移范圍越廣，MMP-9的陽性表達率越高。因此，MMP-2和MMP-9很有可能在NPC發生發展、突破基膜向外擴散及淋巴結轉移過程中起到關鍵作用。MMP-2和MMP-9在轉移瘤細胞和腫瘤組織血管的內皮細胞中高表達，可引起癌細胞侵入基質，導致細胞轉移，加速腫瘤生長、血管生成。可見MMP-2和MMP-9有望成為鼻咽癌抗腫瘤治療的新靶點。

值得一提的是[28]，MMP家族在生物體內自己就具有天然的抑制劑家族——MMP組織抑制劑（TIMP）。20世紀70年代發現了第一個天然MMP組織抑制劑（TIMP-1）以后，目前已發現TIMP-2 、-3和-4共四個成員。TIMP-1能夠抑制可溶性的基質金屬蛋白酶（MMP）。TIMP-2、-3、-4不但能夠抑制可溶性的MMP，而且能夠抑制膜型MMP。

4 LDH

4.1結構與功能

1954年Hill等率先報道惡性腫瘤患者血清乳酸脫氫酶（LDH）活力增高達96%，引起學者關注。迄今為止在人體血清中共發現5種LDH同工酶[29]，可分為骨骼肌型（M型）和心肌型（H型） 兩種亞基。M、H亞基以不同比例構成四聚體同工酶，有以下5種：LDH1=H4、LDH2=H3M1、LDH3=H2M2、LDH4= H1M3、LDH5=M4。LDH主要分布在心、肝、腎、肺及紅細胞等器官和組織的細胞質中。腫瘤組織的代謝主要是糖酵解，明顯高于正常組織，所以參與糖酵解過程的LDH活性亦明顯升高。其機制表現為腫瘤細胞壞死增加，代謝轉換率增快，細胞膜通透性增強，繼而癌組織參與代謝的酶類釋放至血液，導致血清LDH水平增加。有研究表明[30]，癌癥患者的血清和腫瘤組織都提示LDH及其同工酶有變化，而且LDH活性和M亞基的增加與細胞惡性過程相平行。研究表明[30]，大多數惡性腫瘤以LDH3升高為主，少數見LDH5升高，伴隨LDH1、LDH2下降。所以在臨床和科研工作中，監測患者血清LDH及其同工酶水平，可望作為惡性腫瘤的篩選指標、評價療效、判斷預后的方法，目前己用于淋巴瘤、卵巢癌兩種惡性腫瘤。但有部分良性疾病，如急慢性肝功能損害、阻塞性黃疽、心肌損害及骨骼肌疾病，其血清LDH及其同工酶也可以升高，這需要臨床醫生完善患者臨床資料，增加檢查項目鑒別。

4.2與鼻咽癌轉移的關系

眾所周知，腫瘤細胞的糖代謝存在瓦博格效應[31]，即癌細胞不同于正常細胞，無論供氧充足與否，均以無氧酵解作為獲得能量的方式。作為糖酵解代謝途徑中的限速酶，LDH起著非常重要的作用。研究發現惡性腫瘤患者血清中的LDH水平會明顯升高。因此可根據患者血LDH水平初步篩選出患者是否有惡性腫瘤。林馮杰等[31]對NPC患者及健康人群進行血清LDH水平檢測，發現治療前鼻咽癌患者血清LDH水平明顯高過健康人群。陳建華等[32]報道1例鼻咽癌全身多處轉移患者的血清LDH水平最高時是正常值的30余倍。Cheng等[33]報告鼻咽癌患者血清LDH水平偏高者較偏低者易出現遠處轉移，但不影響局部復發率。但也有研究表明NPC患者不論是初診組或者復發組，其血清LDH水平與正常對照組比較無顯著差異。在臨床工作中，發現部分鼻咽癌患者治療前血清LDH已經升高甚至數倍于正常值，分析其原因：第一，患者治療前有可能已存在遠處轉移或亞臨床轉移病灶；第二，由于血清LDH來源于全身多種組織，不僅取決于腫瘤的大小，有部分良性疾病的血清LDH也可以升高；第三，正常情況下，血清LDH水平也不是一成不變的。另外有的鼻咽癌患者治療前LDH水平不高，但治療后患者的LDH水平反而升高，影響因素可能是：①化療藥物對心肌、肝腎細胞等損害；②放射治療對鼻咽腫物殺傷及放射野其他組織損傷的結果。目前原因不明，尚需進行科學實驗和系統臨床研究以明確。

5 ALP

5.1結構與功能

血清堿性磷酸酶譜[34]（包括血清堿性磷酸酶ALP、骨型堿性磷酸酶B-ALP）是一組磷酸單酯水解酶，在堿性條件下能夠催化磷酸基團的水解和轉移。ALP幾乎存在于人體所有組織中，在骨骼（成骨細胞）和肝臟含量最高。ALP主要由成骨細胞分泌，在骨折、惡性腫瘤骨轉移等損傷骨骼時，分泌堿性磷酸酶增加使磷酸鹽沉積，從而修復骨骼，可引起血清ALP活性升高。骨型堿性磷酸酶來源于成骨細胞，如果骨形成大于骨吸收，其血清中濃度會明顯升高。

5.2與鼻咽癌轉移的關系

崔炳強等[35]研究表明NPC骨轉移組、未轉移組血清ALP水平遠高于正常組（P<0.01）；NPC骨轉移組血清ALP水平遠高于未轉移組（P<0.01）；多發骨轉移組遠高于單發骨轉移組（P<0.05）。提示鼻咽癌患者骨轉移程度越重，血清ALP的水平越高。血清ALP是診斷骨骼病變的重要指標，已成為大家共識。研究報道，婦女40歲以后，血清B-ALP水平隨年齡增加而升高，特別是絕經后10年，增加達77%，但于60～80歲開始下降至低水平。對20～80歲的女性志愿者進行調查，證實絕經后B-ALP水平較絕經前升高，和年齡呈顯著相關性，特別是在骨量減少及骨質疏松患者中，B-ALP水平迅速增高，表明B-ALP能夠作為一種敏感標志物來反映骨轉換率[36]。Sham等[37]報道ALP>70 U/L[正常參考值為（31.0～115.0）U/L]的N3期鼻咽癌患者遠處轉移發生率高。

在臨床工作中，我們發現鼻咽癌未轉移患者的ALP水平升高甚至數倍于正常值，其原因可能是：①鼻咽癌患者已經有微小骨轉移灶，但是由于目前檢驗學、核醫學、影像學等條件的限制，無法找到微小骨轉移灶；②堿性磷酸酶雖然在骨骼和肝臟含量最高，但亦存在于人體其他組織中，血清ALP水平增高，反映存在其他部位或器官微小骨轉移灶（除外骨轉移灶）可能。這就需要我們進行大樣本的科學實驗和臨床研究以明確ALP水平與鼻咽癌轉移幾率是否呈正相關。

6 展望

在臨床工作中，我們發現很多早期的鼻咽癌患者治療后短時間內就已經發生遠處轉移。因此與鼻咽癌轉移相關的分子標志物扮演著越來越重要的角色。一方面治療前可通過測定患者鼻咽癌組織或血清、血漿中分子標志物，預測治療后轉移危險度的高低，有利于進行個體化治療，從而降低患者復發率和轉移率。另一方面，根據鼻咽癌相關分子標志物，尋找出藥物新靶點進行針對性更強的抗腫瘤治療，可以提高鼻咽癌患者的治愈率。但是目前絕大多數鼻咽癌相關轉移標志物，存在敏感性差、特異性更差的普遍問題，進一步尋找具有較高敏感性、特異性的標志物任重而道遠。另外很多分子標志物的研究還處于初步探索階段，還需要進行更系統、更大樣本的科學實驗和臨床研究，以明確其發生、發展和調控機制，進而更好地指導臨床診斷和治療。

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（收稿日期：2015-03-23）