低溫貯藏南美白對蝦特定腐敗菌的分離鑒定及腐敗能力分析

謝麗丹,李蕾蕾,王素英,董世瑞

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津,300400)

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低溫貯藏南美白對蝦特定腐敗菌的分離鑒定及腐敗能力分析

謝麗丹,李蕾蕾,王素英*,董世瑞

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津,300400)

摘要為了分離鑒定南美白對蝦在低溫貯藏條件下的腐敗菌并測定其腐敗能力的大小，分別在4 ℃和-18 ℃的低溫條件下貯藏南美白對蝦，從中分離腐敗菌，進行形態學觀察和分子生物學鑒定，并將腐敗菌接種至滅菌蝦汁中進行分解蛋白質對比試驗。結果表明，從南美白對蝦中分離得到12株腐敗菌，分別是Shewanella hafniensis，Acinetobacter johnsonii，Planoccoccus citreus，Bacillus cereus，Acinetobacter beijerinckii，Enterobacter hormaechei，Arthrobacter bergeri和Bacillus licheniformis，其中X1與X10可能為潛在新種或新屬。南美白對蝦優勢腐敗菌致腐能力研究結果顯示：南美白對蝦在冷藏條件下致腐能力強的優勢腐敗菌依次是Acinetobacter johnsonii，X1，Shewanella hafniensis和Acinetobacter beijerinckii；凍藏條件下致腐能力強的優勢腐敗菌依次是Planoccoccus citreus，Acinetobacter johnsonii，Shewanella hafniensis，Acinetobacter beijerinckii和X1。

關鍵詞南美白對蝦；低溫貯藏；優勢腐敗菌；分離鑒定；腐敗能力

眾所周知鮮度是評判蝦類水產品品質的最重要指標，沒有進行任何保鮮處理的鮮蝦，由于營養豐富、含水量高，極易被微生物污染而導致腐敗變質。人們將生存能力強、繁殖快，且產生腐敗臭味代謝產物的特定菌群稱為優勢腐敗菌。相關研究表明，隨著貯藏時間的增加，優勢腐敗菌在菌落總數中的比例不斷增加[1]。因此找出新鮮水產品的優勢腐敗菌對控制其品質具有重要意義。

南美白對蝦是當今養殖產量最高的三大蝦類之一[2]，因此在集中捕撈季節，常采用短期冷藏、長期凍藏的措施以實現銷售的時空調節。溫度是影響南美白對蝦貨架期的關鍵因素[3-5]，但缺乏關于低溫條件下造成南美白對蝦腐敗的細菌菌相構成、變化規律及腐敗能力的系統報道。本文擬對冷藏和凍藏南美白對蝦的主要腐敗菌進行分離純化，采用形態學特征、生理生化試驗以及16S rRNA序列相結合的方法，對優勢腐敗菌進行鑒定，在此基礎上測定其腐敗能力，為延長南美白對蝦的貨架期，制定針對性較強的保鮮方案提供依據。

1材料與方法

1.1實驗材料與儀器

鮮活南美白對蝦，購自天津市南開區王頂堤水產批發市場，立即包裝保活運輸至實驗室；

用于PCR擴增的全部試劑及擴增引物均從生工生物工程(上海)股份有限公司購買與合成；其它生物試劑購自北京奧博星生物技術有限公司。

UDK-159凱氏定氮儀，意大利VELP公司；MLS-3780高壓滅菌鍋，日本SANYO電器集團；SPX-150B-D型振蕩培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；PCR擴增儀，美國ABI公司；JY04S-3C凝膠成像系統，北京君意東方電泳設備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1腐敗菌的分離純化及計數

用碎冰使鮮活南美白對蝦休克，用清水洗凈后瀝干，隨機分成2組，分別冷藏和凍藏，其中冷藏溫度為4℃，凍藏溫度為-18℃。定時取樣采用有氧平板劃線法[6]進行腐敗菌的分離純化和計數。

1.2.2腐敗菌鑒定

肉眼觀察菌落形態，革蘭氏染色后鏡檢記錄菌體的大小、形態、芽孢的有無。在此基礎上采用酚/氯仿抽提法提取腐敗菌基因組DNA[7-9]，利用通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(CTACGGCTACCTTGTTACGA)進行16S rRNA基因擴增，擴增產物由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序所得序列在韓國標準菌株EzTaxon-e數據庫[10]中利用Identify程序進行同源性分析，采用軟件Mega 6.0程序構建系統發育樹。

1.2.3腐敗能力測定

參照徐振偉[13-14]的方法制備無菌蝦汁，將5 μL濃度為106CFU/mL的菌懸液加入到10 mL滅菌蝦汁中，分別貯藏于4℃和-18℃，以未接種的蝦汁為對照，定時取樣，采用凱氏定氮法測定揮發性鹽基氮(TVBN)[15-16]，考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[12]。同時利用三糖鐵培養基中觀察腐敗菌的產硫化氫情況[11]。

2結果與分析

2.1腐敗菌的形態及相關特征

根據菌落形態、個體形態及相關特征，對菌落進行歸類并計數，發現在南美白對蝦冷藏、凍藏過程中，在數量上占優勢并與腐敗有關的不同類型菌落共12種，其特征見表1和表2。

表1　南美白對蝦腐敗菌的菌落特征

表2　南美白對蝦腐敗菌的菌體形態及相關指標

2.2基于16S rRNA基因序列的腐敗菌鑒定

通過腐敗菌與相關標準菌株16S rRNA基因序列的同源性分析，根據同源性≥98%為同一種細菌的共識[17]，結合形態特征等相關指標，對12株腐敗菌進行鑒定，結果見表3。

表3　腐敗菌的鑒定結果

從表3可知，引起南美白對蝦腐敗變質的12株細菌分別是哈夫尼希瓦氏菌(Shewanellahafniensis)，約式不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii)，檸檬色動性球菌(Planoccoccuscitreus)，蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)，拜氏不動桿菌(Acinetobacterbeijerinckii)，霍氏腸桿菌(Enterobacterhormaechei)，伯杰節桿菌(Arthrobacterbergeri)和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。X1和X10雖與不動桿菌屬的菌種親緣關系最近，但同源性非常低，結合菌體形態和革蘭氏染色結果，可以初步判斷它們可能為潛在新種或新屬。

2.3南美白對蝦貯藏過程中腐敗菌的變化規律

圖1　南美白對蝦冷藏及凍藏過程中腐敗菌菌相的變化Fig.1　Thecomposition of bacteria during during cold storage ang frozen storage(注：X34為X3與X4共同計數，X712為X7與X12共同計數)

在南美白對蝦低溫貯藏貨架期內，定時測定腐敗菌的數量，探討優勢腐敗菌隨貯藏時間的變化規律。由圖1和圖2可知，鮮蝦初始菌相中優勢菌株為X1和Acinetobacterjohnsonii，次優勢菌株為Shewanellahafniensis和Acinetobacterbeijerinckii，菌相的構成隨貯藏溫度的不同而發生不同的變化，其中冷藏過程中優勢菌株Acinetobacterjohnsonii和次優勢菌株Shewanellahafniensis所占比例逐漸上升，到貨架期終點時，所占比例分別為34.3%和39.1%，成為主要優勢菌，初始優勢菌株X1、次優勢菌株Acinetobacterbeijerinckii及其他菌株所占比例逐漸下降，到貨架期終點，X1占比例從22%下降至11%，Acinetobacterbeijerinckii所占比例從17%下降至6.8%，剩余菌株合計所占比例為8.8%。與冷藏相比，凍藏過程中各菌株的比例變化更為復雜，其中X1 和Shewanellahafniensis呈現先增加后降低的趨勢；Acinetobacterjohnsonii和Acinetobacterbeijerinckii呈現先下降后上升趨勢； 其余菌株均呈下降趨勢， 35 d時Bacilluslicheniformis未檢出，42 d時Arthrobacterbergeri和X10未檢出。到貨架期終點菌種組成趨于簡單，且優勢菌株與初始菌相明顯不同，數量最多的菌株為Acinetobacterjohnsonii和Planoccoccuscitreus，所占比例分別為30%和31%，次優菌株為X1，Acinetobacterbeijerinckii和Shewanellahafniensis所占比例分別為18%、14%和5%，其余菌株所占比例較低，僅為2%。

綜上分析，由于不同腐敗菌對低溫冷害的敏感性不同，低溫貯藏過程中耐低溫性強的菌株數量所占比例逐漸增大，到貨架期終點，冷藏條件下的數量優勢菌株依次為Acinetobacterjohnsonii，X1，Shewanellahafniensis，Acinetobacterbeijerinckii，凍藏條件下，數量優勢菌株依次為Planoccoccuscitreus，Shewanellahafniensis，Acinetobacterjohnsonii，Acinetobacterbeijerinckii，X1。

圖2　南美白對蝦冷藏及凍藏過程中腐敗菌細菌總數的變化規律Fig.2　The change of the total number of spoilage bacteria of Penaeus vannamei during cold storage ang frozen storage

2.4腐敗菌的致腐能力測定

將接種腐敗菌的無菌蝦汁置于4℃、-18℃保藏，定期取樣測定揮發性鹽基氮和蛋白質濃度，因在貨架期內揮發性鹽基氮呈上升趨勢，蛋白質濃度呈下降趨勢，所以用極差代表貨架期內的發展趨勢，并采用SPSS16.0軟件對極差進行多重比較，顯著性水平為P<0.01,結果見表4和表5。

表4　4℃條件下蛋白質濃度和揮發性鹽基氮的多重比較

注：A,B,C,D,E,F,G,H為多重比較結果,同列標有不同大寫字母者表示組間差異極顯著(P<0.01), 標有相同大寫字母者表示組間差異極不顯著(P>0.01)。

表5　-18 ℃條件下蛋白質濃度和揮發性鹽基氮的多重比較

注：A,B,C,D,E,F,G,H,I為多重比較結果,同列標有不同大寫字母者表示組間差異極顯著(P<0.01), 標有相同大寫字母者表示組間差異極不顯著(P>0.01)。

從表4和表5可以看出，在同一貯藏溫度下，數量優勢菌株產揮發性鹽基氮和降解蛋白質的能力均顯著高于非優勢菌株(P<0.01)，意味著數量優勢菌株即為腐敗優勢菌株。對優勢腐敗菌來說，冷藏條件下，Shewanellahafniensis和Acinetobacterbeijerinckii的蛋白質濃度、揮發性鹽基氮差異不顯著(P>0.01)，致腐能力相近，其他腐敗優勢菌之間均顯著，致腐能力較強的菌株依次是Acinetobacterjohnsonii，X1，Shewanellahafniensis和Acinetobacterbeijerinckii；凍藏條件下，Acinetobacterbeijerinckii與X1的蛋白質濃度和揮發性鹽基氮差異不顯著(P>0.01)，致腐能力相近，其他腐敗優勢菌之間均顯著，致腐能力較強的菌株依次是Planoccoccuscitreus，Acinetobacterjohnsonii，Shewanellahafniensis，Acinetobacterbeijerinckii和X1。

為了進一步探討不同貯藏溫度下，優勢腐敗菌引起鮮蝦腐敗的時間進程，在不同時間點取樣測定揮發性鹽基氮和蛋白質濃度。從圖3和圖4可以看出，各腐敗菌株降解蛋白質產揮發性氨基氮的時間進程基本一致，通過SPSS分析各菌株在同一時間內揮發性鹽基氮和蛋白質濃度的變化，可知低溫貯藏中，不同時間點測定各菌株的揮發性鹽基氮和蛋白質濃度，彼此之間均存在顯著差異(P<0.01)，冷藏貨架期內，Acinetobacterjohnsonii，Acinetobacterbeijerinckii降解蛋白質產揮發性鹽基氮分別是最強和最弱，從第2天開始，Shewanellahafniensis的菌落總數優于X1，但X1的揮發性鹽基氮比Shewanellahafniensis高，蛋白質濃度比Shewanellahafniensis低，進一步證明X1的致腐能力比Shewanellahafniensis強；凍藏貨架期內，Planoccoccuscitreus的降解蛋白質產揮發性鹽基氮最強，Acinetobacterjohnsonii次之，從第28天開始，Acinetobacterbeijerinckii和X1的菌落總數都分別大于Shewanellahafniensis，Shewanellahafniensis的揮發性鹽基氮比Acinetobacterbeijerinckii和X1高，蛋白質濃度比Acinetobacterbeijerinckii和X1低，進一步證明Shewanellahafniensis的致腐能力比Acinetobacterbeijerinckii和X1強，與多重比較結果一致。

另外通過三糖鐵培養基產硫化氫實驗，發現南美白對蝦低溫貯藏過程中的12株腐敗細菌，僅有優勢腐敗菌Shewanellahafniensis在冷藏1d時分解蝦汁蛋白產生硫化氫，可見Shewanellahafniensis是鮮蝦腐敗產生不良氣味的關鍵菌株。

圖3　冷藏條件下降解蛋白質產揮發性鹽基氮的時間進程Fig.3　The time process of the production of volatile base nitrogen and protein degradation during cold storage

圖4　凍藏條件下降解蛋白質產揮發性鹽基氮的時間進程Fig.4　The time process of the production of volatile base nitrogen and protein degradation during frozen storage

3結論

本實驗采用定時取樣，有氧平板分離純化的方法，對冷藏和凍藏南美白對蝦中的腐敗菌進行分離純化，獲得純菌株12株。根據形態、生理生化特征和16S rRNA基因序列對腐敗菌進行鑒定，結果表明，12株腐敗細菌分別為Shewanellahafniensis、Acinetobacterjohnsonii、Planoccoccuscitreus、Bacilluscereus、Acinetobacterbeijerinckii、Enterobacterhormaechei、Arthrobacterbergeri、Bacilluslicheniformis，另外X1和X10菌株可能為潛在的新屬種。同時測定了低溫貯藏過程中南美白對蝦腐敗菌的數量變化及優勢菌株的致腐能力，發現在冷藏條件下，致腐能力最強的是Acinetobacterjohnsonii，其次分別是X1，Shewanellahafniensis，Acinetobacterbeijerinckii。凍藏條件下，致腐能力最強的是Planoccoccuscitreus，其次分別是Acinetobacterjohnsonii，Shewanellahafniensis，Acinetobacterbeijerinckii和X1。

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Isolation and identification of particular spoilage bacteria inPenaeusvannameistored

under low temperature and analysis on their spoilage ability

XIE Li-dan，LI Lei-lei，WANG Su-ying*，DONG Shi-rui

(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300400, China)

ABSTRACTIn order to isolate and identify Penaeus vannamei’s spoilage bacteria and measure their spoilage ability under low temperature storage conditions, the spoilage bacteria were separated from Penaeus vannamei stored under low temperature of 4 ℃ and -18 ℃. The isolated microbes were identified by morphological observation and molecular biology methods. A protein comparative test was carried out through inoculation of spoilage bacteria into sterilized shrimp juice. Results showed that 12 strains of spoilage bacteria were isolated from penaeus vannamei, including Shewanella hafniensis, Acinetobacter johnsonii, Planoccoccus citreus, Bacillus cereus, Acinetobacter beijerinckii, Enterobacter hormaechei, Arthrobacter bergeri, and Bacillus licheniformis, wherein X1 and X10 might be a potential new species or genus. Research on spoilage ability of dominant spoilage bacteria showed that the dominant spoilage bacteria with strong ability for putrefying penaeus vannamei during cold storage were Acinetobacter johnsonii, X1.Shewanella hafniensis and Acinetobacter beijerinckii, and those during frozen storage were Planoccoccus citreus, Acinetobacter johnsonii, Shewanella hafniensis，Acinetobacter beijerinckii, and X1.

Key wordsPenaeus vannamei;low temperature storage;dominant spoilage bacteria;isolation and identification;spoilage ability

收稿日期：2015-09-25，改回日期：2015-11-11

基金項目：國家自然科學基金項目(31270050)；天津市高等學校創新團隊(TD12-5049)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603012

第一作者：碩士研究生(王素英教授為通訊作者，E-mail:wsying@tjcu.edu.cn)。