4種中草藥提取物對靈芝液態發酵三萜產物形成的影響

趙小瑞，贠建民 ，艾對元，張紊瑋，趙風琴，李宏珍，賈亞莉

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)

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4種中草藥提取物對靈芝液態發酵三萜產物形成的影響

趙小瑞，贠建民*，艾對元，張紊瑋，趙風琴，李宏珍，賈亞莉

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)

摘要采用振蕩-靜置兩段培養法，研究了以當歸、黨參、甘草、黃芪4種甘肅道地藥材提取物作為激發子對靈芝液態發酵過程中細胞生長及產靈芝三萜的影響。結果表明：建立的最優兩段發酵條件為發酵液C/N為4∶1，振蕩-靜置轉換時間為第3天，裝液量為50 mL/250 mL。在該條件下，當歸、黨參、甘草、黃芪提取物均能顯著促進靈芝細胞生長及靈芝三萜的產生，但四者的有效作用濃度范圍不同，當歸、黨參醇提物質量濃度在20～80 g/L促進作用良好，甘草、黃芪水提物在5～15 g/L促進作用良好。最佳添加時間分別為當歸第2天，黨參、甘草和黃芪均為第3天。發酵罐驗證試驗表明,4種中草藥提取物是有效的激發子，可促進靈芝發酵三萜產量提高，尤其是當歸添加量為60 g/L時，胞外三萜產量可達964.63 mg/L。

關鍵詞中草藥；提取物；兩段液態發酵；靈芝三萜

靈芝(Ganodema lucidum)為靈芝科靈芝屬藥食兩用真菌，是滋補強壯、扶正固本的珍品，已有2000多年的藥用歷史。迄今為止，已從靈芝子實體中分離到十余類化合物，其中多糖和三萜類化合物為關鍵藥效成分[1-3]。現代藥理研究表明，靈芝三萜具有抗病毒、鎮靜止痛、抑制組織胺釋放、解毒保肝、殺傷腫瘤細胞等藥理活性[4-6]。

液體深層發酵以其機械化、自動化程度高，有利于實現大規模工業化生產而備受關注，已成為獲得靈芝次生代謝產物的主要技術，但如何進一步促進靈芝細胞生長和提高關鍵活性產物的產量仍是人們希望解決的問題[7]。傳統的提高靈芝液態發酵過程中次生代謝產物產量的研究主要集中在優化發酵基質(如C/N)和發酵過程參數(如溶氧和pH)，或補料-分批發酵等策略方面[7-9]。近年來為了進一步提高有效次生代謝產物的產量，一些學者從外界活性因子激發真菌次生代謝產物合成的角度，研究了一些活性因子，如纖維素酶[10]、低聚麥芽糖[10]、Gu2+[11]、真菌激發子[12]、中藥固體粉末[13]、中藥材提取物[14]等對靈芝關鍵代謝產物合成的影響，效果良好。運用中藥材提取物刺激真菌液態發酵技術已成為研究的熱點，但將中藥提取物作為激發子與兩段培養法結合工藝技術研究較少。

當歸、黨參、甘草、黃芪是重要的保健食品原料或藥食同源物，價廉易得，在我國已有悠久的食、藥用史。本試驗在優化建立靈芝液體振蕩-靜置兩段培養技術體系的基礎上，探討4種中草藥提取液在不同添加濃度、不同添加時期下對靈芝細胞生物量(CDW)、胞內靈芝三萜含量(IGA)和胞外靈芝三萜含量(EGA)的影響，以期為創新靈芝工業化發酵技術及中藥材加工增效途徑提供科學依據和參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

靈芝菌種：日本靈芝(Ganoderma japonicum)，由北京吉蕈園科技有限公司提供。

當歸、黨參、甘草、黃芪：藥品級，購自蘭州市安寧區惠仁堂藥店的片劑；玉米粉、麩皮：市購。

甲醇、乙醇、三氯甲烷 、蛋白胨，葡萄糖，瓊脂粉，NaHCO3，KH2PO4，MgSO4·7H2O均為國產分析純試劑。

1.2儀器與設備

UV756CRT型紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；THZ-8臺式恒溫振蕩器，上海佑科儀器儀表有限公司；電熱恒溫培養箱，北京科偉永興儀器有限公司；TD5A-WS臺式低速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠 ；1.5 L全自動機械攪拌發酵罐，上海國強生化工程設備公司。

1.3試驗方法

1.3.1菌種制備

菌種活化：取一小塊保存的靈芝菌苔接種于PDA斜面培養基，28 ℃培養7 d。待菌絲長滿斜面，備用。

搖瓶培養基：玉米粉30 g，麩皮20 g，蛋白胨5 g，葡萄糖20 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，VB10.5 g，水1 000 mL,pH自然。

第一階段菌種培養：在斜面菌種中切取5個瓊脂塊(d=5 mm)，接種到50 mL/250 mL液體培養基中，30 ℃，150 r/min條件下培養5 d；第二階段菌種培養：吸取5 mL第一階段種子液，接種到50 mL/250 mL液體培養基中，30 ℃，150 r/min條件下培養5 d。

1.3.2中草藥提取物制備

參照趙艷等[15-16]方法并略做修改。

甘草、黃芪水提物制備：稱取供試草藥100 g，加10倍量水煎制4 h，8層紗布過濾，藥渣再煎1次，合并藥汁，藥汁減壓濃縮得1 g/mL浸膏，備用。

當歸、黨參醇提物制備：將供試草藥烘干、粉碎，稱取100 g，加10倍量70%乙醇回流提取6 h，過濾，濾液減壓濃縮得1 g/mL浸膏，備用。

1.3.3發酵培養

1.3.3.1兩段式培養基本條件

搖瓶發酵：在250 mL錐形瓶中，裝入適量發酵培養基，每個錐形瓶中按10 mL/100 mL比例接入液體菌種，30 ℃，150 r/min條件下振蕩培養3 d。

靜態培養：將搖瓶培養3d后的發酵基質轉為靜態培養，30 ℃條件下靜置培養16 d。

1.3.3.2液體發酵罐驗證試驗

在1.5 L發酵罐中進行。以第二階段培養的菌絲球為種子液，接種水平保持在10%(v/v)，培養溫度保持在30 ℃，攪拌速率300 r/min，通氣量控制在0.67 v/v/m，攪動發酵3 d后，靜置發酵16 d，通氣量控制在0.3 v/v/m。并分別在培養第2天加入當歸醇提物，使其終質量濃度為60 g/L，第3天加入黨參醇提物、甘草水提物、黃芪水提物，使其終質量濃度分別為60、10和10 g/L。

1.3.3.3兩段培養條件優化

在上述1.3.3.1兩段培養基本條件下，以靈芝三萜產量為主要指標，綜合靈芝細胞生物量，來確定最優C/N、轉換時間點、裝液量。

碳氮比的確定：最適碳氮比是在玉米粉、麩皮比例一定，60 mL /250 mL裝液量情況下，以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源，分別設定碳氮比為2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1(g∶g)，30 ℃，150 r/min條件下分別培養5d，轉為靜態培養，30 ℃條件下靜置培養16 d。

轉換時間的確定：在60 mL/250 mL裝液量情況下，按10 mL/100 mL比例接入液體菌種，30 ℃，150 r/min條件下分別培養1、2、3、4、5、6 d，轉為靜態培養，30 ℃條件下靜置培養16 d。

裝液量的確定：250 mL錐形瓶中，分別裝入10、20、30、40、50、60 mL發酵培養基。其他條件同1.3.3.1。

1.3.3.4中藥添加可行性研究

在50 mL/250 mL發酵培養基中，各加入4種中藥提取物，使其終質量濃度為20 g/L，其他條件同1.3.3.1下，進行兩段培養。通過測定發酵終了時靈芝三萜產量及靈芝細胞生物量，來判斷靈芝發酵中添加中藥對三萜產物的影響。

1.3.3.5當歸、黨參最佳添加量的篩選

在50 mL/250 mL發酵培養基中，各加入當歸、黨參提取物，使其終質量濃度分別為20、40、60、80、100 g/L，按1.3.3.1條件進行兩段培養，篩選最其佳添加量。

1.3.3.6甘草、黃芪最佳添加量的篩選

在50 mL/250 mL發酵培養基中，各加入甘草、黃芪提取物，使其終質量濃度分別為5、10、15、20、25 g/L，按1.3.3.1條件進行兩段培養，篩選最佳其添加量。

1.3.3.7中藥提取物添加時間點的確定

根據上述得出的各中藥提取物最佳濃度，分別于靈芝搖瓶培養第1、第2、第3和第4天加入滅菌中藥提取物，兩段培養結束后，測定靈芝細胞生物量和三萜類物質產量。

1.3.4細胞生物量(CDW)的測定

參照劉媛等[13]方法并略做修改。取發酵液體積V，3 000 r/min離心10 min。沉淀用蒸餾水洗滌多次，收集菌絲體，置烘箱60 ℃烘至恒重，稱重計算生物量。

生物量(g/L)=DCW×1 000 /V

式中:DCW為細胞干重,g；V為發酵液體積，mL。

1.3.5靈芝三萜的測定

參照文獻[17]的方法測定。將發酵物8 000 r/min離心10 min，分別收集菌絲體和發酵液備用。IGA測定：精密稱取干菌絲100 mg，加 3 mL50%(v/v)乙醇4 ℃萃取1周，萃取2次。離心移除菌絲體，上清液在50 ℃下旋轉蒸發干燥。濃縮物溶解在水中，隨后用CHCl3進行萃取。溶解在CHCl3中的靈芝三萜用50 g/L NaHCO3溶液提取，后加入2 mol/L HCl，將NaHCO3層的pH調整到3以下。NaHCO3層的靈芝三萜最后由CHCl3萃取出來。在40 ℃下旋轉蒸發移除CHCl3，萃取物溶解在甲醇中作為粗靈芝三萜。用紫外分光光度儀在245 nm條件下測定靈芝三萜含量。

EGA測定：將培養液收集，加5倍無水乙醇，4 ℃下靜置提取7 d。提取液離心除去雜質后，上清液在50 ℃旋轉蒸發儀中進行干燥。后續操作同上。以不加中藥提取物的發酵液為對照，所有試驗做3個平行。

1.4數據分析

采用Excel 2010進行數據處理，試驗重復次數 n=3，用SPSS19.0統計分析軟件進行方差分析，采用origin8.0繪圖。

2結果與分析

2.1最佳兩段培養條件的建立

2.1.1碳氮比(C/N)

表1　C/N對靈芝細胞生長和靈芝三萜產量的影響

注：1)同列相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)；下同。2)文中所有圖例、表格中CDW代表細胞生物量、IGA代表胞內靈芝三萜含量、EGA代表胞外靈芝三萜含量。

最適碳氮比是在玉米粉、麩皮比例一定，250 mL三角瓶裝液量為60 mL的情況下，以葡萄糖為輔助碳源、蛋白胨為輔助氮源進行研究的。由表1可以觀察到,當C/N為10∶1時，EGA產量最低，僅為215.64 mg/L，表明氮源不足會降低靈芝三萜的產量。另一方面，將C/N從10∶1降到2∶1后EGA產量和CDW提高，在4∶1時達到最大，分別為285.15 mg/L和11.16 g/L，顯著優于C/N為10∶1時的效果。這些結果表明氮源增加有益于細胞生長和靈芝三萜的產生。這一結果與PAPINUTTI[18]得出的結果一致，增加氮源可以提高靈芝細胞生物量，其中 C/N為4∶1時最佳。

2.1.2轉換時間

在兩階段培養過程中，第一階段主要在搖瓶中積累細胞生物量，第二階段在限制供氧量的情況下積累靈芝三萜，第一階段與第二階段之間的轉換點是影響靈芝三萜產生的重要因素[10]。

由圖1可以看出，轉換時間影響靈芝細胞生長和靈芝三萜的產量。第3天時CDW和EGA產量均達到最大，分別為11.03 g/L和327.52 mg/L，IGA在第4天時達到最大(10.75 mg/g)，但與第3天產量差別不大。平衡三者的關系，將第3天定為最佳轉換時間點。

圖1　轉換時間對靈芝細胞生長和靈芝三萜產量的影響Fig.1　Influence of the shift time in tne two-stage cultivation on mycelial growth of Ganoderma japonicum and production of ganoderic triterpenoid

2.1.3裝液量

兩階段培養過程中，添加少量的培養基可以產生較大的比表面積，從而使大量的菌絲體生長在液體表面，在靜態培養過程中長成菌絲墊，產生更多的靈芝三萜。隨著發酵液添加量的增加，EGA含量有所下降，IGA含量及CDW輕微增加(圖2)。當液體培養基添加量為50 mL時，IGA產量(10.64 mg/g)和CDW(11.32 g/L)均達到最大，當培養基添加量為20 mL時EGA含量達到348.04 mg/L。

在試驗中，添加20 mL液體培養基，經過16天的靜置培養，幾乎看不到液體。得到一層厚厚的菌絲墊，大量的菌絲表面可以產生靈芝孢子。報道顯示[19]，菌絲墊上孢子中的靈芝三萜含量比液體培養的菌絲球中的含量多。盡管添加少量液體培養基可以增加EGA含量，但是對CDW的產生造成了消極的影響，進而降低了IGA產量。平衡細胞生物量和靈芝三萜產量，250 mL三角瓶中50 mL液體培養基被認為是最佳添加量。

圖2　裝液量對靈芝細胞生長和靈芝三萜產量的影響Fig.2　Influence of liquid loadings on mycelial growth of Ganoderma japonicum and production of ganoderic triterpenoid in tne two-stage cultivation

2.2添加中藥對靈芝細胞生長和靈芝三萜產量的影響

2.2.1中藥提取物添加的可行性研究

本試驗研究了甘肅四大道地藥材當歸、黨參、甘草、黃芪提取物對靈芝細胞生長及靈芝三萜產生的影響。首先在各中藥添加終濃度均為20 g/L時研究了4種中藥提取物對靈芝細胞生長及靈芝三萜生產的可行性。可以看出，4種中藥提取物終質量濃度為20 g/L時，添加當歸和黨參提取物對靈芝細胞生長和靈芝三萜的產生有一定的促進作用，甘草和黃芪則表現出一定程度的抑制作用(表2)。

表2　不同植物藥提取物(20 g/L)對靈芝細胞

為考察各中草藥提取物有效作用劑量范圍，進一步考察了當歸、黨參醇提取物終質量濃度在20、40、60、80、100 g/L及甘草、黃芪水提取物終質量濃度在5、10、15、20、25 g/L條件下對靈芝細胞生長及靈芝三萜產量的影響。

2.2.2當歸提取物對靈芝細胞生長及產靈芝三萜的影響

由圖3可以看出，隨著當歸添加量的增加，IGA、EGA產量顯著提高，CDW也呈一定的上升趨勢。當歸添加量為80 g/L時EGA產量(595.63 mg/L)及IGA含量(14.47 mg/g)均達到最大，分別比對照增加89.52%、38.47%，CDW也顯著提高，從11.17 g/L上升到13.52 g/L。由此可見，添加一定質量濃度的當歸提取物有利于靈芝細胞生長及靈芝三萜的生成。

圖3　當歸提取物不同添加質量濃度對靈芝細胞生長和靈芝三萜產量的影響Fig.3　Effect of different concentrations of Angelica sinensis alcohol extracts on mycelial growth of Ganoderma japonicum and production of ganoderic triterpenoid

2.2.3黨參提取物對靈芝細胞生長及產靈芝三萜的影響

圖4　黨參提取物不同添加質量濃度對靈芝細胞生長和靈芝三萜產量的影響Fig.4　Effect of different concentrations of Codonopsis pilosula alcohol extracts on mycelial growth of Ganoderma japonicum and production of ganoderic triterpenoid

由圖4可以看出，隨著黨參添加濃度的增加，靈芝三萜產量及靈芝細胞生物量呈一定的上升趨勢。黨參添加濃度為80 g/L時EGA及IGA含量均達到最大，分別比對照增加33.49%、33.27%。CDW也顯著提高，比對照增加了22.20%，說明黨參添加量在一定范圍內有利于靈芝的生長及靈芝三萜的生成。

2.2.4甘草提取物對靈芝細胞生長及產靈芝三萜的影響

由圖5可以看出甘草添加量對靈芝生長有一定影響。靈芝細胞生物量隨甘草添加量的增加呈先上升后下降趨勢，在添加量為15 g/L時達到最大(12.31 g/L)。EGA、IGA含量均在15 g/L時達到最大，分別為354.00 mg/L、11.30 mg/g。由此可見甘草提取物在5～15 g/L的添加范圍內有利于靈芝的生長及靈芝三萜的生成。

圖5　甘草提取物不同添加質量濃度對靈芝細胞生長和靈芝三萜產量的影響Fig.5Effect of different concentrations of Glycyrrhiza uralensis Fisch water extracts on mycelial growth of Ganoderma japonicum and production of ganoderic triterpenoid

2.2.5黃芪提取物對靈芝細胞生長及產靈芝三萜的影響

黃芪添加濃度對靈芝液態發酵的影響如圖6所示。

圖6　黃芪提取物不同添加濃度對靈芝細胞生長和靈芝三萜產量的影響Fig.6　Effect of different concentrations of Radix astragali water extracts on mycelial growth of Ganoderma japonicum and production of ganoderic triterpenoid

黃芪提取物添加質量濃度在5～15 g/L范圍內時，IGA含量及CDW均呈緩慢的上升趨勢，EGA呈先上升后下降趨勢，變化顯著；但超過15 g/L時，靈芝三萜含量及細胞生物量均明顯下降。CDW及EGA、IGA含量均在添加量為10 g/L時達到最大，分別為11.52 g/L、10.94 mg/g、344.73 mg/L。由此可見，黃芪在5～15 g/L添加范圍內對靈芝液態發酵有一定的促進作用，但超過15 g/L時則呈現明顯的抑制作用。

2.2.6中藥提取物添加時期的確定

為了考察4種中藥提取物加入時間對靈芝生物量和靈芝三萜積累的影響，分別將60 g/L當歸、黨參和10 g/L甘草、黃芪各設置4個加入時間分別加入靈芝發酵培養基中進行培養。結果表明(圖7)，加入時間不同，各中藥提取物對靈芝細胞生長和靈芝三萜積累產生了不同的影響。當歸在第2天加入時，對EGA和CDW促進作用明顯，黨參在第3天加入時對IGA、EGA和CDW促進作用最明顯。甘草、黃芪均在第3天加入時促進效果良好，尤其是對EGA的促進作用較大。

2.2.7發酵罐驗證試驗結果

在1.5 L發酵罐驗證試驗結果如表3所示。可以看出，添加適量的4種中草藥提取物可以有效促進靈芝液態發酵過程中細胞生物量和靈芝三萜的積累。當歸、黨參添加量為60 g/L時，EGA從315.68 mg/L分別增加到964.15 mg/L和874.19 mg/L；甘草、黃芪添加量為10 g/L時，EGA分別為585.26 mg/L和546.22 mg/L。顯然當歸醇提取物是一種非常有效的可增加靈芝三萜產量的激發子。這比TANG[9]等在5.5 L帶攪拌器的發酵罐中運用pH-轉換和通氣量轉換結合的連續發酵培養過程中生產出了754.6 mg/L的靈芝三萜的效果更好。

表3　發酵罐驗證試驗結果

3結論

本試驗優選的靈芝液體振蕩-靜置兩段搖瓶培養的最優條件為：C/N為4∶1，轉換時間為第3天，裝液量為50 mL/250 mL。在兩段液體培養條件下，添加4種甘肅道地藥材的提取物可以促進靈芝生長和靈芝三萜產量，但4者的有效作用質量濃度不同，其中當歸和黨參提取物在20～80 g/L范圍內可有效促進靈芝細胞生長和產靈芝三萜能力，甘草和黃芪有效作用質量濃度為5～15 g/L。4種中藥提取物最佳添加時間：當歸為第2天，黨參、甘草和黃芪均為第3天。發酵罐驗證試驗證明4種供試中草藥提取物是有效的激發子，可促進靈芝三萜產量提高，同時證明其工業化生產具有一定的可行性。

圖7　中草藥提取物添加時間對靈芝細胞生長和靈芝三萜產量的影響Fig.7　Effect of different addition times of four kinds herds extracts on mycelial growth of Ganoderma japonicum and production of ganoderic triterpenoid

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Effects of four kinds of Chinese herbs extracts on ganoderma triterpenoids production ofGanodermajaponicumin submerged fermentation

ZHAO Xiao-rui, YUN Jian-min*, AI Dui-yuan, ZHANG Wen-wei, ZHAO Feng-qin, LI Hong-zhen, JIA Ya-li

(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

ABSTRACTIn this work, a two-stage culture process by combining shake culture with static culture was proposed to study the effects of four kinds of Chinese herbs (Angelica sinensis, Codonopsis pilosula, Glycyrrhiza uralensis and Radix astragali) on production of ganoderma triterpenoids and mycelium growth. The results showed that the optimum two-stage cultivation conditions were as follows: fermentation broth C / N was 4∶1, two-stage shift time was the 3rd day, and culture volume was 50 mL/250 mL. Under these conditions, four kinds of extracts could all significantly enhance cell growth biomass and the production of ganoderma triterpenoids, but their effective concentration ranges were different. The alcohol extracts of Angelica sinensis and Codonopsis pilosula were effective within 20～80 g/L, however, the water extracts of Glycyrrhiza uralensis and Radix astragali could enhance ganoderic triterpenoids production within 5～15 g/L. The best adding time for Angelica sinensis extract was on the 2nd day, and the others were on the 3(rd) day. Verification test in 1.5 L fermentor showed that four herbs extracts were effective elicitors, which could promote the production of ganoderic triterpenoids. Especially when addition of Angelica sinensis alcohol extracts in fermentation broth was 60 g/L, the yield of extracellular triterpenoids reached 964.63 mg/L.

Key wordsChinese herbs; extracts; two-stage fermentation; ganoderma triterpenoids

收稿日期：2015-10-30，改回日期：2015-12-17

基金項目：甘肅省科技支撐計劃(1304FKCN063)；甘肅農業大學青年導師基金(GAU-QNDS-201205)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603017

第一作者：碩士研究生(贠建民教授為通訊作者，E-mail：yunjianmin@gsau.edu.cn)。