鹽脅迫對發菜胞外多糖結構及其理化性質的影響

路苗，陳雪峰，趙秀霞，王寧，王貴春，孫玉姣

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安， 710021)

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鹽脅迫對發菜胞外多糖結構及其理化性質的影響

路苗，陳雪峰*，趙秀霞，王寧，王貴春，孫玉姣

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安， 710021)

摘要對液體培養的發菜細胞進行鹽脅迫處理，研究鹽脅迫對發菜胞外多糖結構及其部分理化性質的影響。提取純化正常及鹽脅迫培養下的發菜胞外多糖(分別命名為NEPS、YEPS)，測定糖含量、單糖組成、糖苷鍵類型、保濕性、吸濕性、熱穩定性等，分析發菜胞外多糖對鹽脅迫的響應。結果表明：NEPS與YEPS單糖組成種類一致，但含量發生明顯變化；紅外光譜、高碘酸氧化分析可知，兩者特征吸收峰基本一致，均有β-D-吡喃葡萄糖及糖醛酸，糖苷鍵鍵型主要以1—6為主，可能存在1—2、1—4鍵；原子力顯微鏡觀察顯示NEPS與YEPS的分子微觀結構存在明顯差異，NEPS呈尖錐狀結構，YEPS呈棒狀結構；YEPS的吸濕性及熱穩定性均高于NEPS。

關鍵詞發菜；胞外多糖；鹽脅迫；化學結構；理化性質

發菜，學名發狀念珠藍細菌(Nostocflagelliforme)，是一種光合自養型陸生藍細菌。發菜胞外多糖(extracellular polysaccharide, EPS)是發狀念珠藻分泌到細胞外的長鏈多糖，包裹于細胞及藻絲體外，對細胞起保護作用，使其能抵御外部惡劣的生長環境。此外，發菜多糖還具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等生物活性[1]，具有極高的藥用價值和開發潛力。

近年來，發狀念珠藍細菌對逆境脅迫的響應備受國內外學者的關注，藻細胞在逆境脅迫條件下，形態、功能及抗逆活性物質等產生了相應變化[2-4]。陳雪峰[5]等研究了發菜細胞在不同濃度鹽脅迫下胞外多糖的分泌量，結果發現處于0.3 mol/L NaCl脅迫環境時，EPS的分泌量較正常培養細胞增加了50.3%。本課題重點研究了鹽脅迫對多糖的結構和部分理化性質的影響，系統分析比較了2種培養環境下發菜多糖的單糖組成、糖苷鍵鍵型、微觀結構及部分物化性質(保濕性、吸濕性和熱穩定性能)的變化。

1材料與方法

1.1材料與試劑

發菜，寧夏銀川賀蘭山東部；乙腈，色譜純；BG-110培養基、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、咔唑、濃硫酸、三氟乙酸(TFA)、單糖標準品、高碘酸鈉、碘酸鈉、二甲基亞砜、殼聚糖、甘油，均為分析純。

1.2儀器與設備

Waters1525-2487高效液相色譜系統，美國Waters公司；紫外-可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；VERTE70傅立葉紅外光譜分析儀，德國Bruker公司；SPA400原子力顯微鏡，日本精工株式會社；STA449 F3熱重分析儀，德國Bruker公司。

1.3實驗方法

1.3.1發菜細胞鹽脅迫處理

無菌條件下離心收集指數生長末期的發菜細胞，重新接種于NaCl濃度為0.3 mol/L的BG-110培養液中，對照組不含NaCl，在光照強度60 μmol/(m2·s)，光暗比12∶12，溫度白天25℃，夜晚10℃，連續培養10 d。發菜胞外多糖的提取純化參照陳雪峰等[6]的研究方法，培養液離心(10 000 r/min，10 min)去除藻細胞，濃縮上清液，采用Sevage法去除蛋白后加4倍體積分數95%乙醇沉淀12 h，沉淀物加水溶解后透析48h，干燥得粗多糖。粗多糖經DEAE-52離子交換柱層析分離得到多糖純化物，冷凍干燥后用于結構鑒定及理化性質測定，正常環境及鹽脅迫環境下發菜胞外多糖純化物分別命名為NEPS、YEPS。

1.3.2總糖及糖醛酸含量分析

以葡萄糖為標準，采用苯酚-硫酸法測定多糖中總糖的含量。以葡萄糖醛酸為標準，采用硫酸-咔唑法測定多糖中糖醛酸的含量[7]。

1.3.3單糖組成分析

采用柱前衍生高效液相色譜法測定發菜胞外多糖的單糖組成。色譜條件：色譜柱：Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)；流動相：乙腈(A)-0.05 mol/L pH 6.9磷酸鹽緩沖液(B)；洗脫模式：梯度洗脫，時間梯度為0 min→10 min→20 min→35 min→40 min，對應流動相體積分數梯度20%→20%→23%→25%→20%(A)；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：245 nm；進樣體積：20 μL。

1.3.4紅外光譜分析

分別稱取NEPS與YEPS樣品，與充分干燥的溴化鉀混合壓片，在4 000～600 cm-1區間內進行紅外光譜掃描。

1.3.5高碘酸氧化分析

參照孫利芹等[8]的研究方法。分別稱取4 mg NEPS與YEPS樣品，溶于4 mL 15 mmol/L的高碘酸鈉溶液中，在低溫、避光條件下進行氧化。間隔12 h取樣，測定223 nm處的吸光值。通過標準曲線計算每摩爾糖基消耗高碘酸的量。同時取樣2.5 mL反應液，滴加2滴乙二醇終止反應，放置20 min后以溴甲酚紫為指示劑，用0.010 15 mol/L NaOH(用鄰苯二甲酸氫鉀標定)標準液滴定甲酸生成量。

1.3.6原子力顯微鏡觀測

分別配制10 μg/mL 的NEPS、YEPS多糖溶液。大氣環境中、室溫下采用SPA400多功能掃描探針顯微鏡對發菜多糖的分子形態進行掃描觀測。圖像均在contact模式下進行，微懸臂長200 pm，探針為Si3N4，彈性系數0.2 N/m。AFM圖像的形態學特征均采用原子力顯微鏡附帶軟件進行分析。

1.3.7吸濕性測定

參照劉紅輝等[9]的研究方法。將待測樣品及對照品置于真空干燥箱內，50℃干燥24 h，準確稱取干燥后的NEPS、YEPS、甘油和殼聚糖30 mg于稱量瓶中，控制環境溫度20℃，將200 mL飽和NaCl溶液倒入干燥器底部，保持環境密閉性。每隔10 h稱重1次，計算吸濕率(式1)。

(1)

式中：mn為放置n小時后樣品及稱量瓶總質量，mg；mo為放置前樣品及稱量瓶總質量，mg；m為樣品的質量，mg。

1.3.8保濕性測定

將變色硅膠、待測樣品及對照品置于真空干燥箱內，50℃干燥24 h，將200 g變色硅膠放入干燥器底部，控制環境溫度為20℃。準確稱取干燥后的NEPS、YEPS、甘油和殼聚糖30 mg于稱量瓶中，分別加入2滴蒸餾水充分混勻，放入干燥器中，保持環境密閉性。每隔10h取出稱重，計算保濕率(式2)：

(2)

式中：mn為放置n小時后樣品、蒸餾水及稱量瓶總質量，mg；mo為放置前樣品、蒸餾水及稱量瓶總質量，mg；m為樣品與蒸餾水的質量，mg。

1.3.9熱穩定性測定

采用綜合熱分析儀檢測發菜胞外多糖樣品的熱力學特性曲線。測定條件：樣品用量為8 mg，氮氣氛圍中測試，氣體流速20 mL/min；升溫程序為室溫～800 ℃，升溫速率10 ℃/min。

2結果與分析

2.1鹽脅迫對發菜胞外多糖化學結構的影響

2.1.1總糖及糖醛酸含量分析

對不同環境培養的發菜胞外多糖理化性質分析具體數據見表1，結果表明，NEPS與YEPS的總糖含量分別為73.43%、75.48%，糖醛酸含量分別為6.37%、7.39%。

表1　含量分析

2.1.2單糖組成分析

如圖1所示，NEPS與YEPS均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖等單糖組成，NEPS單糖對應摩爾比為0.71∶0.37∶0.44∶1.53∶1.03∶0.40，YEPS單糖對應摩爾比為1.02∶0.48∶0.57∶1.47∶1.40∶0.34。2種培養環境下的胞外多糖單糖組成種類一致，但對應的比例發生了明顯的變化，鹽脅迫環境下甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸以及半乳糖的含量明顯高于正常環境，而葡萄糖與木糖的含量有所降低。有其他藻類的研究證實，微生物胞外多糖的合成分泌與生長環境有著密切聯系[10-11]。

2.1.3紅外光譜分析

圖2為2種培養條件下發菜胞外多糖的紅外光譜圖，其分析結果示于表2。NEPS與YEPS在4 000～500 cm-1內具有多糖性質的一般特征吸收， 其中1 630 cm-1處的吸收峰是羧酸離子伸縮振動，可以斷定含有糖醛酸，867 cm-1處是β-D-吡喃葡萄糖的特征吸收峰，該結論與單糖組成的測定結果一致[12-14]。

圖1　混合標準單糖(A)、NEPS水解物(B)和YEPS水解物(C)HPLC色譜圖Fig.1　HPLC chromatograms of mixed standard monosaccharides and the hydrolyzate of NEPS and YEPS

圖2　NEPS(A)與YEPS(B)紅外光譜圖Fig.2　The IR spectrum of NEPS and YEPS

吸收波數/cm-1NEPSYEPS特征官能團振動方式3539/33393552/3405O—H鍵的伸縮振動2923/28462915/2864C—H鍵的伸縮振動16301621CO鍵的伸縮振動14191431C—H鍵的變角振動11451136醇羥基—OH鍵的變角振動867867β-D-吡喃葡萄糖

2.1.4高碘酸氧化反應

高碘酸反應是一種選擇性氧化反應，可以選擇性地斷裂糖分子中連二羥基或三羥基處，產生相應多的糖醛、甲醛或甲酸。反應定量進行，每斷開1 mol C—C鍵消耗1 mol高碘酸，生成1 mol甲酸消耗2 mol高碘酸。根據高碘酸氧化標準曲線及樣品高碘酸氧化曲線(圖3)，計算得高碘酸氧化數據，結果列于表3。

由表3可知，低溫下避光處反應168 h后，高碘酸氧化反應完全， NEPS與YEPS均有甲酸生成，說明存在1-6鍵型，而兩者高碘酸消耗量均大于甲酸生成量的2倍，說明其中有C—C鍵消耗了高碘酸卻不產生甲酸，很有可能存在1—2，1—4鍵型[8]。

圖3　高碘酸鈉消耗量標準曲線(A)與樣品高碘酸氧化曲線(B)Fig.3　The sample curve of periodate oxidation

2.1.5原子力顯微鏡觀測結果

NEPS與YEPS原子力顯微鏡觀測結果如圖4所示。圖4-a′是NEPS的3D地形圖， 可看到分子形貌如尖錐狀結構，高度約5～20nm，直徑約50～300 nm。圖4-a中可看到單獨游離于溶液的糖鏈結構，直徑約20 nm，長度約2 000 nm。說明尖錐結構是由多個糖鏈纏繞形成，這可能是由于多糖分子間的相互作用以及糖醛酸形成的鏈間氫鍵所致。YEPS分子形貌呈現棒狀結構，高度約60 nm，長度約1 200～2 000 nm，以及糖鏈旋轉纏繞形成的聚集體，未見單獨的糖鏈結構。造成發菜胞外多糖分子微觀結構差異的原因可能是由于YEPS含有較多的糖醛酸，氫鍵及分子間作用力增大，從而形成更為緊密的聚集體[15]。

表3　高碘酸氧化結果分析

圖4　NEPS(a-a′)與YEPS(b-b′)AFM圖Fig.4　AFM images of NEPS and YEPS

2.2鹽脅迫對發菜胞外多糖理化性質的影響

2.2.1鹽脅迫對發菜胞外多糖吸濕性的影響

以甘油和殼聚糖為對照品，考察NEPS、YEPS及對照品的吸濕性能(圖5)。由圖5可知，多糖樣品及甘油的吸濕率在10 h內迅速增長，10 h后甘油的吸濕率繼續增強，30 h后趨于飽和，多糖樣品的吸濕率10 h后基本趨于飽和，殼聚糖吸濕率較弱，維持在5%以下。 50 h，樣品的吸濕率分別為甘油63.6%、YEPS 31.0%、NEPS 15.5%和殼聚糖3.7%。結果表明，YEPS、NEPS和殼聚糖的吸濕率均明顯小于甘油，而YEPS的吸濕率比NEPS明顯提高。吸濕率的增強與樣品所含親水性基團數量息息相關，YEPS吸濕率的增強，說明鹽脅迫處理致使單糖組成發生變化，增加了糖鏈中親水基團的數量。

圖5　NEPS、YEPS、甘油、殼聚糖吸濕性能Fig.5　Moisture absorption rate of NEPS,YEPS,glycerin and chitosan

2.2.2鹽脅迫對發菜胞外多糖保濕性的影響

以甘油和殼聚糖為對照品，考察NEPS、YEPS及對照品的保濕性能(圖6)。由圖6可知，各樣品的保濕率隨著時間的推移而減小，其保濕率大小的順序為：殼聚糖>YEPS>NEPS>甘油。造成這種結果的原因可能是甘油是小分子，在干燥環境中其小分子結構限制了其與水結合的能力。2種發菜胞外多糖均具有良好的保濕性，保濕率均在40%以上，YEPS保濕率略高于NEPS。

圖6　NEPS、YEPS、甘油、殼聚糖保濕性能Fig.6　Moisture retention rate of NEPS,YEPS,glycerin and chitosan

2.2.3鹽脅迫對發菜胞外多糖熱穩定性的影響

從TG/DTG曲線(圖7)得知，NEPS和YEPS熱分解曲線分為3個階段，兩者具有相似的熱力學性質，但也存在不同之處(表4)。40～170 ℃是降解的第一階段，失重主要是失去多糖物理作用吸附的水分；200～350 ℃是降解的第二階段，樣品在高溫下分子內部化學鍵斷裂，YEPS與NEPS分別于260 ℃、269 ℃達到降解最大速率；700～800 ℃是降解的第三階段，降解結束后NEPS失重比率明顯高于YEPS，說明鹽脅迫使發菜胞外多糖結構更加穩定，具有更高的熱穩定性。

圖7　NEPS(A)與YEPS(B)的TG/DTG曲線Fig.7　TG-DTG curves of NEPS(A) and YEPS(B)

單位：%

3結論

鹽脅迫是存在于干旱、半干旱和灌溉地的一種主要的脅迫形式。藍藻分布范圍極廣，具有很好的耐鹽性，目前已有大量關于藍藻對鹽脅迫響應的報道，但其代謝產物對鹽脅迫的響應未見深入研究。本課題以正常環境和鹽脅迫環境培養所得的胞外多糖為材料，通過分析發現兩者單糖種類、糖苷鍵類型等化學結構基本一致，但單糖組成、微觀結構及部分理化性質有明顯的差異。NEPS呈規則的尖錐狀結構，YEPS則呈棒狀結構，體積約為前者的6～8倍 ，YEPS的吸濕性及熱穩定性也高于NEPS。鹽脅迫下的發菜胞外多糖對環境產生了一定的響應，可見次級代謝產物的合成受到了逆境的影響，產生了相應的變化，但逆境下的合成規律仍需進一步研究，為逆境響應機制提供數據基礎。

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Effects of salt stress on structural characteristics and functional properties of extracellular polysaccharide fromNostocflagelliforme

LU Miao, CHEN Xue-feng*, ZHAO Xiu-xia, WANG Ning,WANG Gui-chun, SUN Yu-jiao

(College of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021,China)

ABSTRACTNostoc flagelliforme cells were cultured under salt stress to explore the changes in structural characteristics and physicochemical properties of extracellular polysaccharide. Monosaccharide composition, glycoside bond, moisture absorption and moisture resistance changes were discussed to analysis the response of extracellular polysaccharide to salt stress. The results indicated that the monosaccharide composition of NEPS and YEPS changed significantly. IR, periodate oxidation analysis showed that NEPS and YEPS, which were basically the same characteristic absorption peaks, both contained β-D-glucopyranose and uronic acid. Glycoside bond type was mainly dominated 1—6, but 1—2, 1—4 may exist. Atomic force microscopy images showed that there were obvious differences of NEPS and YEPS, the former formed pyramid structure, and the latter formed rod-like structure. YEPS showed better moisture absorption and thermal stability than NEPS.

Key wordsNostoc flagelliforme；extracellular polysaccharide；salt stress；structural characteristics； physicochemical properties

收稿日期：2015-08-28，改回日期：2015-11-04

基金項目：國家青年科學基金項目(31401633)；陜西科技大學科學基金后補助項目(2014XHBZ-10)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603021

第一作者：碩士研究生(陳雪峰教授為通訊作者，E-mail：chenxf@sust.edu.cn)。