酶解法制備甲魚油工藝研究

陶軼松，吳芮，包建強

(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

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酶解法制備甲魚油工藝研究

陶軼松，吳芮，包建強*

(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

摘要運用酶解法從甲魚四肢根部的脂肪中提取甲魚油，利用單因素實驗與響應面結合的方法，得到優化的工藝條件：酶解溫度61 ℃，酶添加量1.25 %、料液比1∶1.5、酶解時間2.5 h。通過此方法得到的提取率為76.3%。再利用脫膠、脫酸、脫臭和脫色四步精制方法將甲魚油進行精制，并對其理化指標和脂肪酸組成進行分析。測得的精制甲魚油的理化指標均符合國家精制魚油一級標準，且測得的脂肪酸共33種，其中不飽和脂肪酸含量高達78.13%。

關鍵詞甲魚油；精制；脂肪酸

中華鱉，又名甲魚，是我國特色水產品，它營養豐富，味道鮮美，是傳統食材。隨著20世紀90年代養殖技術的成熟，從1995年的1.9萬t到2014年的34.12萬t[1]，我國甲魚養殖產量突飛猛進。我國甲魚消費市場很大，在宰殺過程中會產生內臟、脂肪等廢棄物。這些廢棄物不僅會污染環境，同時也是資源浪費，充分利用這些廢棄物成為未來甲魚開發的一個熱點。

陸生動物脂肪中含有的不飽和脂肪酸遠比水生動物脂肪中要少，TAPIERO等人[2～7]發現，不飽和脂肪酸具有降低體內膽固醇、降低血黏度、軟化血管、增加血液的循環等功效。現今，提取甲魚油的方法主要有蒸煮法、稀堿法、超臨界CO2萃取法、酶解法等[8-14]。傳統的方法在提取過程中常常會破壞一些成分，影響甲魚油的品質[15-16]。酶解法是利用蛋白酶對蛋白質的水解，破壞蛋白質和脂肪的結合，從而使油脂釋放出來。該方法作用條件溫和，產油質量高，是提取水產品下腳料中魚油的較好方法[17]。因此，本研究使用酶解法制備甲魚油，優化工藝條件，采用精制的方法將提取到的甲魚油進行精制，同時測定其理化指標及脂肪酸組成。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1原料與試劑

原料：甲魚的四肢根部成塊狀的黃色脂肪塊；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、肽酶、胰蛋白酶、復合蛋白酶，上海辛森化學科技有限公司。

NaCl、NaOH、H3PO4均為分析純級，14%三氟化硼-甲醇溶液、正己烷均為色譜級，國藥集團化學試劑公司提供；37種脂肪酸甲酯混標，美國Supelco?公司提供。

1.1.2儀器與設備

SHIMADZU AUY220型電子分析天平，IKA? HB 10 數顯型加熱鍋，DHG-9073BS-III型新苗恒溫鼓風干燥箱，DK-S28型精宏水浴鍋，TRACE GC ULTRA氣相色譜儀，LXJ-IIB低速大容量多管離心機，檢測器為FID(美國Thermo Fisher)。

1.2實驗方法

1.2.1原料前處理

將原料活甲魚進行宰殺，取出甲魚身體中的脂肪，切割至2～3 mm的脂肪塊大小，隨后將脂肪塊裝入袋中，儲藏在-50 ℃下備用。

1.2.2酶解法提取甲魚油工藝流程

取出凍結甲魚脂肪，在4 ℃下解凍，按照料液比1∶1.5 (g∶mL)加水，按中性蛋白酶添加量1.2%、酶解時間2.5 h、60 ℃下酶解，然后在4 500 r/min、20 min離心，得到上層粗甲魚油。評判提取效果以甲魚油提取率為依據。

1.2.3提取率的計算(公式(1))

(1)

1.2.4蛋白酶的篩選

在料液比為1∶1 (g∶mL)，根據不同蛋白酶的活性溫度，以酶添加量0.8%分別加入堿性蛋白酶、中性蛋白酶、肽酶、復合蛋白酶、胰蛋白酶，酶解3 h，評判提取效果以甲魚油提取率高低為依據，且同時進行空白對照實驗。

1.2.5魚油提取工藝多因素條件優化

在單因素實驗的基礎上，采用響應面Design-Expert的實驗設計，設計3因素3水平實驗確定酶解法提取甲魚油的最佳工藝條件，響應面的實驗因素及水平如表1所示。

表1　因素水平編碼表

1.2.6甲魚油精制工藝

粗甲魚油在70 ℃水浴中加熱，向油中加入質量分數為1%的H3PO4溶液進行脫膠，離心，提取上層魚油；脫膠魚油在80 ℃水浴中加熱，向油中加入質量分數為9%的NaOH 溶液(濃度為2.25 mol/L)進行脫酸，離心，提取上層魚油；脫酸魚油在50 ℃水浴中加熱，加入質量分數為20%的活性白土，脫色20 min，隨后離心，提取出上層魚油；脫色魚油在90 ℃水浴中加熱，0.09 MPa旋蒸的條件下，旋蒸60 min最終得到精制甲魚油。

1.2.7魚油理化性質測定及脂肪酸組成

酸值(AV)：參照GB/T 5530—2005；過氧化值(POV)：參照GB/T 5538—2008；碘值：參照GB/T 5532—2008(韋氏法)；皂化價： 參照GB/T 5534—2008；不皂化物：參照GB/T5535.1—2008(乙醚提取法)；水分及揮發物含量：參照GB/T 5528—2008；油脂灰分：參照GB/T17375—2008。脂肪酸組成分析：參照GB/T 22223—2008測定。

2結果與分析

2.1蛋白酶種類的選取

從圖1可知，空白試驗由于未添加酶在所有提取率中是最低的，只有28.78%。在加入蛋白酶之后，甲魚油提取率有明顯的上升。由于不同蛋白酶對肽鍵的專一性不同，導致蛋白酶的水解能力不同[18],因此提取率也有顯著性差異。其中中性蛋白酶提取率最高，達到72.37%。所以，選擇中性蛋白酶提取甲魚油。

圖1　不同蛋白酶對甲魚油提取率的影響Fig.1　Effect of different protease on oil extraction注：字母不同代表不同提取率之間存在顯著性差異(P<0.05)

2.2單因素實驗

2.2.1酶解時間對于提取率的影響

在酶添加量為0.8%，酶解溫度60 ℃，料液比1∶1，酶解時間在0.5，1，1.5，2，2.5和3 h下的情況下，酶解時間對提油率的影響，根據甲魚油提取率確定酶解時間，結果如圖2所示。

圖2　酶解時間對提取率的影響Fig.2　Effect of time of enzymatic hydrolysis on oil extraction rate

從圖2可知，甲魚油的提取率隨著酶解時間的增加而增大，提取率的增長速率隨著酶解時間的增加而減小。當酶解時間超過2.5 h時，提取率開始下降，并且甲魚油的品質會隨著酶解時間的增加而降低，甲魚油暴露在空氣中的時間越長，甲魚油中的不飽和脂肪酸會被氧化的越多，從而影響甲魚油的品質。所以，最適合的酶解時間為2.5 h。

2.2.2酶添加量對于提取率的影響

在溫度60 ℃，料液比1∶1，酶添加量分別為0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2.0%，酶解2.5 h的情況下，酶添加量對提取率的影響結果如圖3所示。

圖3　酶添加量對提取率的影響Fig.3　Effect of enzyme dosage on oil extraction rate

從圖3可知，隨著酶添加量的增加，甲魚油提取率表現出先上升后下降的特點。當酶添加量達到1.2%，提取率最高，達到72.99%。當酶添加量少的時候，主要是酶控制反應，當酶添加量多的時候主要是底物控制反應，當酶多的時候，酶會相互影響，妨礙酶對底物的水解作用。李夢凡[19]研究酶解法制備羅非魚油時，隨著酶添加量的增加，魚油提取率也表現出先上升后下降的特點，這與其實驗結果基本一致。因此，最適合的酶添加量為1.2%。

2.2.3料液比對于提取率的影響

在溫度60 ℃，酶添加量1.2%，料液比(g∶mL)分別為1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶2.5，酶解2.5 h的情況下，料液比對提取率的影響，根據甲魚油提取率確定酶添加量，結果如圖4所示。

圖4　料液比對提取率的影響Fig.4Effect of ratio of tilapia head to water on oil extraction rate

從圖4可知，甲魚油的提取率隨著料液比的增加呈現出先上升后下降的趨勢，當料液比達到1∶1.5的時候，提取率達到最大為75.24%。當在加入少量水的時候，底物中的酶分子分布不均勻，使底物和酶不能良好的接觸，加水過多時，底物和酶分子接觸機會降低，也會影響甲魚油的提取率。因此，適合的料液比為1∶1.5。

2.2.4酶解溫度對于提取率的影響

在酶添加量1.2%，料液比1∶1.5，酶解溫度分別為45，50，55，60和65 ℃，酶解2.5 h的情況下，酶解溫度對提取率的影響如圖5所示。

圖5　酶解溫度對提取率的影響Fig.5　Effect of hydrolysis temperature on extraction yield

從圖5可知，在60 ℃之前，隨著酶解溫度的升高，甲魚油的提取率上升，在60 ℃的時候，取得最大值為75.72%，在60 ℃之后，甲魚油提取率下降。溫度對酶促反應較復雜，升溫加速分子運動，但同時升溫也會對酶的活性、最大反應速度及底物產生影響。因此，適合的酶解溫度為60 ℃。

2.3甲魚油提取工藝優化

2.3.1響應面優化結果

從單因素實驗中得到酶解法提取甲魚油的條件為：酶解時間2.5 h，酶添加量1.2%，料液比1∶1.5，酶解溫度60 ℃。因為從單因素實驗中獲得酶解時間在2.5 h以后的甲魚油提取率趨于接近，所以固定酶解時間2.5 h。因此選擇酶解溫度(A)、酶添加量(B)和料液比(C)3個因素設計響應面實驗。響應面方案設計及結果見表2。

表2　響應面分析方案及實驗結果

通過Desingn-expert軟件對表4中得到的提取率數據進行二次多元擬合，得到了提取率Y對A、B、C的二次多元回歸方程:提油率(Y)= 75.72+3.73A+2.46B-0.35C-1.73AB+0.78AC+0.76BC-3.13A2-3.99B2-0.87C2。在方程中各項的系數的絕對值大小可以反應出各項因數對響應值的影響程度。各項系數的正、負可以反應影響的方向，由二次項的系數為負可以推斷出方程式所代表的曲線開口向下，具有極大值，可以進行優化分析。回歸方程的方差分析，如表3所示。

表3　回歸模型系數檢驗

注：“*”為差異顯著(P<0.05)；“**”為差異極顯著(P<0.01)。

通過對表3的分析，此模型極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)，說明此模型建立成功，可用此模型分析和預測甲魚油提取率。RAdj2=0.9439說明該模型擬合程度良好，實驗誤差較小，該模型是合理的；變異系數CV=1.44，CV較低說明實驗具有較好的可靠性模型的相關系數R2=0.9755，表示回歸方程中所有自變量的變化可以解釋97.55%因變量的變化，表明回歸方程可以很好地描述考察因子與響應值之間的關系。從表3回歸系數顯著性檢驗顯示，酶解溫度的一次項和二次項與酶添加量的一次項和二次項，影響都達到極顯著水平(P<0.01)；酶解溫度與酶添加量的交互項影響達到顯著性水平(P<0.05)。由P值可知，各工藝因素對提取率影響大小依次為：酶添加量>酶解溫度>料液比。同時根據回歸方程得到最佳工藝參數為：酶解溫度61.2 ℃，酶添加量1.24%，料液比1∶1.56，在此條件下的提取率為76.98%。

2.3.2驗證實驗

由該模型得到的最佳甲魚油提取工藝參數為：酶解溫度61.2 ℃，酶添加量1.24%，料液比1∶1.56，在此條件下的提取率為76.98%。從實際生產角度考慮，確定最佳魚油提取工藝為：酶添加量1.25%，酶解溫度61 ℃，料液比1∶1.5。在此條件下進行平行實驗3次，所得到的提取率的平均值為76.3%，相對誤差0.87%，與預測的結果基本一致。證明此模型能夠很好的模擬并預測酶解法提取魚油的得率，進一步的證明了此模型的可行性。

2.4甲魚油的精制及理化

按照1.2.6工藝對甲魚油進行精制。并對其進行理化指標測定，結果如表4所示。

表4　酶解法制備粗甲魚油與精制魚油理化性質

從表4中可知，甲魚油在精制之前，其水分及揮發物，酸值，雜質都略高于國家二級標準。過氧化值，碘值，不皂化物都符合國家一級標準。

2.5甲魚油的脂肪酸組成

參照GB/T 22223—2008測定，對甲魚油脂肪酸組成進行分析，結果如表5所示。

表5　粗甲魚油與精制甲魚油脂肪酸組成

表5為酶解法制備粗甲魚油與精制甲魚油的脂肪酸組成分析，粗甲魚油精制后脂肪酸組成變化不大，總體上單不飽和脂肪酸(MUFA)所占比例最高的是油酸，多不飽和脂肪酸(PUFA)以亞油酸為主，EPA與DHA的總比例均約為9.7%，油酸、EPA等所占脂肪酸比例與韓玉謙[19]、吳惠勤[20]等人測定比例相似，而DHA、亞油酸含量相對較高。

精制甲魚油中不飽和脂肪酸UFA(78.13%)含量豐富，其中MUFA占到總量的50.52%，而PUFA占到總量的27.61%。還含有人體必需脂肪酸α-亞麻酸，亞油酸和花生四烯酸。PUFA對清除自由基，預防心血管疾病具有一定的功效[21]。

3結論

(1)通過對4種提取魚油的方法進行比較可以發現，因為酶解法比超臨界CO2萃取法成本低，且比蒸煮法以及稀堿法提油效果好，所以可以作為提取甲魚油的理想方法。

(2)采用單因素結合響應面分析法對酶解工藝進行優化，得到魚油提取率與各因素的二元多項回歸方程：Y(%)=75.72+3.73A+2.46B-0.35C-1.73AB+0.78AC+0.76BC-3.13A2-3.99B2-0.87C2。確定最佳魚油提取工藝條件：酶解溫度61 ℃，酶添加量1.25%、料液比1∶1.5、酶解時間2.5 h，提取率為76.3%。

(3)粗甲魚油經過精制得到精制甲魚油。精制甲魚油的的理化指標全部達到國家水產行業精制魚油一級標準。精制的甲魚油的脂肪酸組成共鑒定出33種脂肪酸，其中MUFA含量為50.52%,PUFA含量為27.61%，EPA+DHA含量為9.7%。

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Research of Chinese soft-shelled turtle oil by enzymatic hydrolysis

TAO Yi-song，WU Rui，BAO Jian-qiang*

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

ABSTRACTChinese soft-shelled turtle oil was extracted from its fat by enzymatic hydrolysis. The optimal conditions were as follows：enzymolysis temperature was 61℃, compound protease dosage was 1.25 %, material-water ratio was 1∶1.5, enzymolysis time was 2.5 h and the extraction rate was 76.3 %. The crude oil was refined through four steps including degumming, deacidification, decoloration and deodorization. The physical and chemical properties and fatty acid compositions of refined oil were analyzed. All of physical and chemical properties were accorded with national standard for refined fish oil at first grade. And thirty-three kinds of fatty acids in refined Chinese soft-shelled turtle oil were identified. The content of unsaturated fatty acids was 78.13 %.

Key wordsChinese soft-shelled turtle oil；refining；fatty acid

收稿日期：2015-09-22，改回日期：2015-11-11

基金項目：上海海洋大學水產動物遺傳育種中心(ZF1206)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603032

第一作者：碩士研究生(包建強教授為通信作者，E-mail: baojq@shou.edu.cn)。