超臨界CO2萃取所得細齒櫻桃籽油和揮發油的抗氧化活性和成分分析

楊瀟，羅靜，張廣峰，秦佳

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039)　2(小金縣夾金山天然野櫻桃酒業有限公司，四川 小金，624200)

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超臨界CO2萃取所得細齒櫻桃籽油和揮發油的抗氧化活性和成分分析

楊瀟1*，羅靜1，張廣峰1，秦佳2

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039)2(小金縣夾金山天然野櫻桃酒業有限公司，四川 小金，624200)

摘要采用超臨界CO2工藝萃取得到細齒櫻桃籽油及其揮發油并對其抗氧化活性和化學成分進行分析。結果表明: 細齒櫻桃籽油具有較高的抗氧化活性，其成分由14種脂肪酸組成, 其中不飽和脂肪酸占88.12%，主要為油酸(47.09%)和亞油酸(38.69%)。細齒櫻桃籽揮發油經氣相色譜-質譜聯用-自動質譜退卷積定性系統(gas chromatography-mass spectrometry-automocted mass spectral deconfolotion and iderclification system, GC/MS/AMDIS)分析,鑒定出17種主要物質, 其中主要成分是具有多種藥理學活性的β-谷甾醇(60.3%)。

關鍵詞細齒櫻桃籽油；揮發油；抗氧化；成分分析

細齒櫻桃(CerasusserrulaFranch. Yu et Li)，又名“四川櫻桃”、“野櫻桃”，屬薔薇科(Rosaceae)李亞科 (Prunoideae) 櫻屬(Cerasus)細齒組 (Sect.Serrula)喬木。主要分布于四川、云南、西藏，生長于海拔2 600～3 900 m的山坡草地和山谷林中[1]。屬地域性稀缺特種資源，營養極為豐富，果肉和果皮可入藥，具清肺利咽，止咳的功效。由于生長海拔高，少有病蟲害浸襲和農藥的污染，是不可多得的綠色食品。但細齒櫻桃鮮果為低糖、高酸且不耐運輸儲藏，基本沒有鮮果銷售的商業價值。目前主要作為野櫻桃果酒、罐頭、果脯等深加工的原料，而在這些加工過程中產生的大量櫻桃籽，則大部分用作動物飼料生產或直接廢棄，造成極大的資源浪費和環境污染。

由于目前針對細齒櫻桃籽開發的基礎研究較少，本研究對采用超臨界CO2萃取的細齒櫻桃籽油和揮發油的抗氧化活性、理化性質及化學成分進行了全面的研究。

1材料與方法

1.1材料與試劑

細齒櫻桃由小金縣夾金山天然野櫻桃酒業有限公司提供；CO2(純度>99．0%)，成都僑源氣體有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH)，購自美國Sigma公司; 石油醚、KOH、無水乙醚、三氯甲烷、無水Na2SO4，均為國產分析純。

1.2儀器與設備

HA 221-50-06型超臨界萃取裝置，南通市華安超臨界萃取設備有限公司；BS323S電子分析天平，賽多利斯科學儀器北京有限公司；XFB-400小型粉碎機， 中南制藥機械廠；GCMS-2010 plus 氣相色譜質譜聯用儀，日本島津；SOX-406脂肪測定儀，濟南海能儀器股份有限公司；M100多功能酶標儀，奧地利Tecan公司。

1.3櫻桃籽預處理

將櫻桃果肉與櫻桃籽進行分離，并將櫻桃籽清洗后置于電熱鼓風干燥箱中50 ℃烘干、粉碎，60目過篩后，置于干燥器內室待用。

1.4櫻桃籽中粗脂肪含量和揮發油含量的測定

根據“GB/T 14772—2008 食品中粗脂肪的測定”所提供方法測定細齒櫻桃籽中的粗脂肪含量。根據”GB/T 30385—2013 香辛料和調味品揮發油含量的測定”所提供方法檢測細齒櫻桃籽中揮發油含量。

1.5超臨界CO2萃取櫻桃籽油和揮發油

稱取500 g櫻桃籽粉裝入超臨界CO2萃取裝置中，在萃取溫度50 ℃、萃取時間120 min、CO2流量20 L/h的條件下進行萃取，分離釜1的壓力10 MPa，溫度40 ℃。分離釜2壓力為5 MPa，溫度30 ℃。從分離釜1和分離釜2中收集樣品。

1.6超臨界CO2萃取細齒櫻桃籽油的理化性質測定

取超臨界CO2萃取的細齒櫻桃籽油，參照GB/T 5530—2005提供方法測定其酸值;參照“GB/T5532—2008 動植物油脂碘值的測定”中提供的方法測定碘值;參照“GB/T 5527—2010 動植物油脂折光指數的測定”中提供的方法測定折光指數;參照“GB/T 5534—2008 動植物油脂皂化值的測定” 中提供的方法測定皂化值;參照“GB/T 5535.1—2008 動植物油脂不皂化物測定”中提供的方法測定不皂化物含量;參照“GB/T 5537—2008 糧油檢驗磷脂含量的測定”中提供的方法測定磷脂含量。

1.7櫻桃籽油和揮發油抗氧化活性測定

采用DPPH(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl)法進行抗氧化活性測定[2-3]，通過檢測對DPPH自由基清除率來比較超臨界CO2萃取所得櫻桃籽油和揮發油的抗氧化活性。取5 μL樣品加入120 μL無水乙醇稀釋，置于96孔酶標板中，加入275 μL的DPPH溶液，于酶標儀內室溫避光反應90 min，同時以無水乙醇為空白，每5 min于517 nm波長處測定吸光值。 每個樣品取4個平行樣，按下列公式計算DPPH自由基清除率。同時以油酸為對照組。

DPPH自由基清除率/%=[1-(As-Ac)/A0]×100

式中:A0,125 μL無水乙醇 + 275 μL DPPH溶液的吸光度值;As,125 μL樣品稀釋液 + 275 μL DPPH溶液的吸光度值;Ac,125 μL樣品稀釋液 + 275 μL無水乙醇的吸光度值。

1.8櫻桃籽油中脂肪酸組成分析

準確稱取0.5 g 櫻桃籽油于10 mL具塞試管中，分別加入5.0 mL 0.4 mol/L NaOH-甲醇溶液，渦旋混合20 s，每5 min搖勻1次，室溫下反應40 min,分別加入5.0 mL正己烷，搖勻，靜置分層，取上清液分別加入0.5 g無水Na2SO4干燥，用0.22 μm過濾器過濾后，供GC-MS聯用儀分析。

分析條件如下：氣相色譜條件：Rtx-5MS毛細管色譜柱(30 m ×0.25 mmID×0.25 μm)； 采用程序升溫，100℃維持6 min，6 ℃/min，升至230 ℃，停留10 min；載氣為高純He (99.999%)，載氣流量1.0 mL/min；柱前壓57.4 kPa；汽化室溫度為250 ℃；進樣量1 μL；分流比10∶1。質譜條件：EI 離子源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度：200 ℃；接口溫度250 ℃；電子能量70 eV；倍增器電壓1.8 kV；溶劑延時4 min；掃描方式：SCAN；質量掃描范圍40～550 amu。

1.9櫻桃籽揮發油成分的GC/MS/AMDIS分析

取從分離釜2中收集所得櫻桃籽揮發油，用甲醇按5%的比例將其稀釋后采用GC/MS 聯用儀進行檢測，分析條件如下：氣相色譜條件：Rtx-5MS毛細管色譜柱(30 m ×0.25 mmID×0.25 μm)； 采用程序升溫，150 ℃維持3 min，5 ℃/min，升至280 ℃，停留6 min；載氣為高純He (99.999%)，載氣流量1.0 mL/min；柱前壓57.4 kPa；汽化室溫度為220 ℃；進樣量1 μL；分流比20∶1。質譜條件：EI 離子源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度：200 ℃；接口溫度280 ℃；電子能量70 eV；倍增器電壓1.8 kV；溶劑延時4 min；掃描方式：SCAN；質量掃描范圍40～450 amu。由于櫻桃籽揮發油中成分十分復雜，總離子流色譜圖(TIC)中可能存在著重疊峰，甚至內嵌峰，從而影響成分的鑒別。因此可通過自動質譜退卷積定性系統(AMDIS，version 2.69, National Institute of Standards and Technology)進行重疊峰拆分分析[4]，再應用NIST質譜搜索程序(version 2.0 d, National Institute of Standards and Technology)從NIST11譜庫中檢索出相應的化合物。

2結果與討論

2.1超臨界CO2萃取細齒櫻桃籽油的理化性質

細齒櫻桃籽中粗脂肪含量為(8.9±0.2) %，揮發油含量為(0.56±0.15) %。采用超臨界CO2萃取后，從分離釜1中收集到呈淡黃色透明狀的櫻桃籽油, 從分離釜2中收集到呈無色透明狀，具有芳香氣味的櫻桃籽揮發油。其中櫻桃籽油經檢測，其主要理化性質見表1。

表1　細齒櫻桃籽油理化性質

2.2超臨界CO2萃取細齒櫻桃籽油的抗氧化活性分析

細齒櫻桃籽油、揮發油與油酸對DPPH自由基清除率的時間效應變化見圖1。當反應體系中存在5 μL/mL 油樣的條件下，三者對DPPH自由基清除率均隨著時間的延長先急劇增加而后趨于平穩。而細齒櫻桃籽油對DPPH自由基的清除能力在多個時間點上均顯著高于油酸，最終的自由基清除率超過50%，表明細齒櫻桃籽油具有較高的抗氧化能力；而櫻桃籽揮發油對DPPH自由基的清除能力卻略低于油酸，表明其抗氧化能力并不高。這暗示著細齒櫻桃籽油和揮發油具有完全不同的成分。

圖1　櫻桃籽油和揮發油自由基清除率時間效應曲線Fig.1　Time effect curve of free radicals clearance rate from serration cherry seed oil and volatile oil

2.3超臨界CO2萃取細齒櫻桃籽油的的脂肪酸組成

通過超臨界CO2萃取工藝所得細齒櫻桃籽油甲酯化處理后, 經GCMS分析所得TIC圖見圖2,經NIST08庫比對檢索，共檢測出14種主要脂肪酸(見表2)。其中以油酸、亞油酸、亞麻酸為主的不飽和脂肪酸含量達88.18%，高于目前文獻所報道的普通櫻桃籽油中不飽和脂肪酸含量[5-7]。由于不飽和脂肪酸具有保證細胞的正常生理、酯化膽固醇降低血脂、改善血液微循環、提高腦細胞的活性等生理功能[8]，因此細齒櫻桃籽油具有較高的營養價值。但是油脂中不飽和脂肪酸含量較高又存在著易于氧化變質的問題，因此當以細齒櫻桃籽為原料進行油脂加工時應實施抗氧化保護。

圖2　細齒櫻桃籽油脂肪酸甲酯總離子流色譜圖Fig.2　TIC of serration cherry seed oil fatty acid methyl esters

序號甲酯化產物保留時間/min名稱結構縮寫相對含量/%113.913棕櫚酸(hexadecanoicacid)C16∶05.43215.422棕櫚油酸(9-hexadecenoicacid)C16∶10.06315.90315-甲基十六烷酸(methylisoheptadecanoate)C17∶00.05417.209亞油酸(9,12-octadecadienoicacid)C18∶238.69517.352油酸(9-octadecenoicacid)C18∶147.04617.833硬脂酸(octadecanoicacid)C18∶01.62719.957亞麻酸(9,12,15-Octadecatrienoicacid)C18∶31.15820.45711,14-二十碳二烯酸(11,14-Eicosadienoicacid)C20∶20.11920.6687,10,13-二十碳三烯酸(eicosatrienoicacid)C20∶30.291021.01311-二十烯酸(11-eicosenoicacid)C20∶10.841121.483花生酸(eicosanoicacidr)C20∶04.21223.198二十一碳烷酸(heneicosanoicacid)C21∶00.161324.868山崳酸(docosanoicacid)C22∶00.281428.011二十四烷酸(tetracosanoicacid)C24∶00.08

2.4櫻桃籽揮發油的化學成分

圖3　細齒櫻桃籽揮發油總離子流色譜圖Fig.3　TIC of serration cherry seed volatile oil

超臨界CO2萃取工藝所得細齒櫻桃籽揮發油經GCMS-AMDIS分析后所得TIC圖見圖3，共鑒定出匹配因子大于750的化合物17種(見表3)，其主要成分為β-谷甾醇、扁桃酰胺等，其中含量最高的β-谷甾醇被證明具有抗炎[9]、解熱、降血脂[10]和抗腫瘤[11]等多種藥理學活性，在醫藥領域具有廣泛的用途。而最新的研究也表明櫻桃籽揮發油對大、小鼠急性炎癥模型都具有顯著的抑炎癥作用[12]。因此本研究的結果也闡明了櫻桃籽揮發油中的抗炎癥活性物質很可能就是其中高含量的β-谷甾醇。由于β-谷甾醇的含量高達60.3%，使得細齒櫻桃籽揮發油可以作為β-谷甾醇的生產原料而具有重要的商業價值。

表3　細齒櫻桃籽揮發油成分

3結論

細齒櫻桃籽中粗脂肪含量為(8.9±0.2)%，揮發油含量為(0.56±0.15) %。當采用超臨界CO2萃取時，可同時提取到櫻桃籽油及揮發油。細齒櫻桃籽油中油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸含量達88.18%，屬于高油酸亞油酸型油脂，具有較高的抗氧化活性。細齒櫻桃籽揮發油中β-谷甾醇含量達60.3%，研究已證明β-谷甾醇具有抗炎癥活性[9]，且最新的研究也證明櫻桃籽揮發油對大、小鼠急性炎癥模型都具有顯著的抑炎癥作用[12]。說明細齒櫻桃籽揮發油可能具有抗炎癥活性。因此本研究的結果不僅提示了細齒櫻桃籽在食品和醫藥領域均具有較好的開發前景，也為細齒櫻桃的進一步精深加工利用提供了基礎數據。

參考文獻

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Antioxidant activity analysis and composition analysis of seed oil and volatile oil extracted by supercritical CO2from serration cherry

YANG Xiao1*, LUO Jing1, ZHANG Guang-feng1, QIN Jia2

1 (Food and Bioengineering School， Xihua University, Chengdu 610039, China)2 (Xiaojin Jiajin Mountain Natural Wild Cherry Wine Co., Ltd., Xiaojin 624200, China)

ABSTRACTSeed oil and volatile oil from serration cherry have been extracted by supercritical CO2, their antioxidant activities and chemical composition were analyzed. The results show that seed oil had a high antioxidant activity, composed of 14 fatty acids, 88.48% of which was the unsaturated fatty acid. The main components of seed oil were oleic acid (47.09%) and linoleic acid (38.69%). The GC/MS/AMDIS analysis demonstrated that 17 kinds of major substance in volatile oil, 60.3 % of which was β-sitosterol, whith has a variety of pharmacological activities.

Key wordsserration cherry seed oil; volatile oil; antioxidant; component analysis

收稿日期：2015-08-08，改回日期：2015-10-09

基金項目：阿壩州野櫻桃全產業鏈現代生產技術集成與產業化示范(四川省科技廳科技支撐項目，編號：2015NZ0075)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603037

第一作者：博士，高級實驗師(本文通訊作者，E-mail：yangxiao19810625@163.com)。