VSVG/HIV-1NL4-3Luc假病毒篩選抗HIV-1藥物的條件優(yōu)化及應(yīng)用

王 萍，陳 歡，羅榮華，卿 晨，張高紅，鄭永唐

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500；2.中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，中國科學(xué)院和云南省動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650223；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100039）

VSVG/HIV-1NL4-3Luc假病毒篩選抗HIV-1藥物的條件優(yōu)化及應(yīng)用

王 萍1，2，陳 歡2，3，羅榮華2，卿 晨1，張高紅2，鄭永唐2

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500；2.中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，中國科學(xué)院和云南省動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650223；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100039）

目的 建立并優(yōu)化VSVG/HIV-1NL4-3Luc假病毒篩選抗HIV藥物藥效模型。方法 參照Promega 公司的熒光素酶活性分析系統(tǒng)，比較VSVG/HIV-1NL4-3Luc對(duì)4種不同細(xì)胞的感染力。通過采用3種不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)不同類型HIV-1上市藥物進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可行性與有效性。最后，應(yīng)用該系統(tǒng)對(duì)特定靶點(diǎn)化合物進(jìn)行篩選，并與HIV-1ⅢB病毒篩選體系所得結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 VSVG/HIV-1NL4-3Luc對(duì)CRFK細(xì)胞的感染力最強(qiáng)，報(bào)告基因的表達(dá)水平與加入的病毒量呈劑量依賴關(guān)系。比較3種實(shí)驗(yàn)條件下不同陽性藥物抑制VSVG/HIV-1NL4-3Luc的半數(shù)有效劑量濃度EC50，發(fā)現(xiàn)第3種條件最優(yōu)。而用該假病毒對(duì)合成化合物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)其EC50與病毒HIV-1ⅢB所得EC50基本一致。結(jié)論 成功建立并優(yōu)化了基于VSVG/HIV-1NL4-3Luc假病毒的抗HIV藥物篩選系統(tǒng)。

VSVG/HIV-1NL4-3Luc，HIV，藥物篩選，陽性藥物，優(yōu)化，應(yīng)用

自1987年第1個(gè)抗HIV藥物齊多夫定（zidovudine，AZT）獲得美國FDA的批準(zhǔn)上市以來，經(jīng)過30多年的不懈努力，目前總共有28種抗HIV單體藥物獲批上市［1－2］。根據(jù)作用機(jī)制的不同，抗HIV藥物可以分為6個(gè)經(jīng)典類型，包括核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（nucleoside reverse transcriptase in-hibitors，NRTIs）、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs）、蛋白酶抑制劑（pro-tease inhibitors，PIs）、融合抑制劑（fusion inhibitors，F(xiàn)Is）、輔助受體抑制劑（coreceptor inhibitors，CRIs）和整合酶抑制劑（integrase strand transfer inhibitors，INIs）［3－6］。

傳統(tǒng)篩選抗HIV藥物的方法是使用活病毒檢測抗HIV活性［7］，其操作流程復(fù)雜，工作量大，鑒于HIV病毒的高危害性，實(shí)驗(yàn)條件要求較高，需在3級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，且易發(fā)生職業(yè)暴露，操作人員有一定的風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋求一種替代活病毒的方法來進(jìn)行抗HIV藥物篩選和研究勢在必行。假病毒技術(shù)就是在這樣的背景下應(yīng)運(yùn)而生的，與活病毒相比，假病毒具有更高的生物安全性、宿主嗜性廣、滴度高及穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［8－9］，已廣泛應(yīng)用于疫苗研發(fā)［10］、病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用［11］、病毒敏感細(xì)胞的篩選［12］、抗病毒藥物篩選［13－16］、中和抗體研究［17］等多個(gè)方面。

HIV-1假病毒感染細(xì)胞系統(tǒng)是指通過使用HIV-1假病毒感染易感細(xì)胞來模擬病毒的感染及復(fù)制過程，并以此進(jìn)行HIV-1相關(guān)研究的系統(tǒng)［18］。通常通過選擇合適的易感細(xì)胞和引入靈敏度高且易于檢測的報(bào)告基因等方法來對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化。目前被廣泛應(yīng)用于HIV研究的假病毒主要有VS-VG/HIVΔenv和HIV ENV/HIVΔenv兩類［19］。本文將表達(dá)水皰性口膜炎病毒包膜糖蛋白的質(zhì)粒（pCMV-VSVG）與HIV-1骨架質(zhì)粒（pNL4-3 Luc R－E－）［20］共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后獲得了VSVG/HIVΔenv假病毒［21］（Fig 1），其能感染不同類型的細(xì)胞，具有廣泛的宿主細(xì)胞譜。該假病毒因?yàn)槿笔Я薍IV必需的env基因、vpr基因和nef基因，無法包裝出新病毒，只能進(jìn)行單輪復(fù)制［22－23］，具有較高的安全性，可在2級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。此外，在nef缺失的位置引入熒光素酶報(bào)告基因（Luciferase，Luc），為檢測HIV-1假病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制水平提供了一條快速靈敏的途徑。

我們對(duì)VSVG/HIV-1NL4-3Luc在不同細(xì)胞中的感染能力進(jìn)行了比較，并設(shè)計(jì)了3種實(shí)驗(yàn)條件來檢測各種類型陽性藥物對(duì)VSVG/HIV-1NL4-3Luc的抑制作用，旨在優(yōu)化該假病毒模型體系。將優(yōu)化后的系統(tǒng)用于針對(duì)不同靶點(diǎn)合成的化合物篩選，并與活病毒HIV-1ⅢB所得結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩者的EC50基本一致，說明VSVG/HIV-1NL4－3Luc是一個(gè)安全、有效地抗HIV-1藥物篩選模型。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和化合物 人胚腎細(xì)胞（293T）、人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）和貓腎細(xì)胞（CRFK）均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）購自ATCC，人白血病T淋巴細(xì)胞（C8166）和病毒HIV-1ⅢB均由英國MRC，AIDS Reagent Project惠贈(zèng)；質(zhì)粒pCMV-VSVG和pNL4-3 Luc R－E－均為中國科學(xué)院生物物理所高光俠研究員惠贈(zèng)，按照康為世紀(jì)離心柱法提取質(zhì)粒試劑盒進(jìn)行大提后，測得濃度分別為pCMV-VSVG（276 mg·L－1），pNL4-3 Luc R－E－（768 mg·L－1）；陽性藥物：zidovudine（AZT，NR-TI）購自Sigma，nevirapine和efavirenz（NVP，EFV，NNRTI）購自U.S.P，Indinavir（IDV，PI）由昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院李玉葉博士惠贈(zèng)，Enfuvirtide（T-20，F(xiàn)I）購自Roche Inc，Maravoric（MVC，CCR5I）和AMD3100（CXCR4I）購自Sigma，Raltegravir（RAL，INI）購自Selleck Chemicals?；衔顳Y系列為大連醫(yī)科大學(xué)馬曉東老師提供，F(xiàn)NC為鄭州大學(xué)常俊標(biāo)老師提供，A5為南開大學(xué)郭宇博士提供，均溶解于DMSO，4℃保存。

Fig 1 Schematics of pNL4-3 Luc R－E－

1.2 VSVG/HIV-1NL4-3Luc的制備 所用轉(zhuǎn)染試劑為Lipo-fectamine 2000（Invitrogen）。轉(zhuǎn)染前1 d，將293T細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)1×107接種于10 cm培養(yǎng)皿中。24 h后，待細(xì)胞密度達(dá)到60％～80％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟按照說明書進(jìn)行操作，pNL4-3 Luc R－E－與pCMV-VSVG的濃度比為4∶1。轉(zhuǎn)染4～6 h后，吸棄上清，用PBS清洗，并加入新鮮的培養(yǎng)基，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，收集上清液，3 000 r· min－1離心5 min，用0.45 μm微孔濾膜過濾，分裝，于－80℃保存。

1.3 細(xì)胞系的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用4株細(xì)胞（293T、HeLa、CRFK、Vero）進(jìn)行假病毒感染效率的比較，接種細(xì)胞密度均為1×104/孔。

1.4 感染性檢測 感染前1 d，將細(xì)胞接種到96孔板上，24 h后將VSVG/HIV-1NL4-3Luc假病毒以不同的濃度感染細(xì)胞。感染48 h后，PBS清洗，每孔加入細(xì)胞裂解液100 μL，裂解30 min，將熒光素酶底物與細(xì)胞裂解液按1∶1混合后采用Promega公司的熒光素酶活性分析系統(tǒng)對(duì)報(bào)告基因熒光素酶的活性進(jìn)行分析［24］。

1.5 3種實(shí)驗(yàn)條件下陽性藥物的檢測 將不同類型陽性藥物AZT、NVP、EFV、IDV、T-20、MVC、AMD3100、RAL在如下3種實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測，藥物5倍稀釋，共設(shè)6個(gè)梯度，每個(gè)梯度3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算其EC50。所有條件均設(shè)加病毒的陽性對(duì)照孔（positive control，PC）和沒有病毒的陰性對(duì)照孔（negative control，NC）。如Fig 2所示，3種方案均為96孔板先接種細(xì)胞24 h，經(jīng)過藥物與病毒的不同處理后，采取48 h為時(shí)間點(diǎn)測RLU值。

Fig 2 Flow chart of 3 experimental conditions

1.6 化合物篩選 對(duì)針對(duì)特定靶點(diǎn)合成的不同類型化合物用VSVG/HIV-1NL4-3Luc假病毒系統(tǒng)進(jìn)行篩選，并與HIV-1ⅢB結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 VSVG/HIV-1NL4-3Luc可高效感染CRFK細(xì)胞 我們將假病毒感染4種細(xì)胞（293T、CRFK、HeLa和Vero）后，經(jīng)3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如Fig 3所示，CRFK能被VSVG/HIV-1NL4-3Luc高效感染，而293T、HeLa和Vero則感染率相對(duì)較低。所以之后的研究采用CRFK細(xì)胞。

Fig 3 VSVG/HIV-1NL4-3Luc infection efficiency on different cells（n＝3）

2.2 被感染CRFK中Luc表達(dá)水平與加入病毒量呈劑量依賴關(guān)系 如Fig 4所示，加入不同稀釋濃度的假病毒感染CRFK細(xì)胞48 h后，被感染細(xì)胞裂解液的熒光素酶活性水平與病毒的加入量呈劑量依賴關(guān)系。由此證明，被感染細(xì)胞中Luc的表達(dá)水平可以體現(xiàn)HIV-1的復(fù)制水平。經(jīng)過3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，選擇20倍稀釋后的病毒用于之后的實(shí)驗(yàn)，其RLU值＞10 000。

Fig 4 RLU under different VSVG/HIV-1NL4-3Luc concentrations（n＝3）

2.3 3種不同實(shí)驗(yàn)條件下陽性藥物對(duì)VSVG/HIV-1NL4-3Luc的抑制作用 在3種實(shí)驗(yàn)條件下檢測各類型陽性藥物對(duì)VSVG/HIV-1NL4-3Luc的抑制作用。AZT、EFV、NVP和RAL均表現(xiàn)出了較好的抗HIV-1活性，而MVC、T-20、IDV和AMD3100在濃度高達(dá)1 μmol·L－1也沒有檢測到其對(duì)假病毒的抑制活性（Tab 1），說明該系統(tǒng)能檢測逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和整合酶抑制劑，不能用于HIV-1進(jìn)入抑制劑和蛋白酶抑制劑的篩選。AZT、EFV、NVP、RAL在3種實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)VS-VG/HIV-1NL4-3Luc的抑制曲線如Fig 5所示，從圖中可以看出，整體上第3種實(shí)驗(yàn)方案優(yōu)于第1種和第2種，所以之后的實(shí)驗(yàn)采用第3種實(shí)驗(yàn)方案。

Tab 1 EC50of HIV-1 inhibitors against VSVG/HIV-1NL4-3Luc

2.4 VSVG/HIV-1NL4-3Luc篩選不同類型化合物 接下來我們利用建立的優(yōu)化方法篩選了一批化合物，并對(duì)活性較好的樣品采用實(shí)驗(yàn)室已有成熟的抗HIV藥物活病毒篩選體系［7，25］進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果如Tab 2所示。比較VSVG/HIV-1NL4-3Luc（CRFK）體系與HIV-1ⅢB（C8166）體系所得各化合物的EC50，發(fā)現(xiàn)EC50值基本一致，因藥物為5倍梯度稀釋，其差值在可允許范圍內(nèi)。

Fig 5 Anti-HIV-1 drugs inhibit VSVG/HIV-1NL4-3Luc in 3 experimental conditions（n＝3）

Tab 2 Comparison of EC50of anti-HIV-1 compounds between VSVG/HIV-1NL4-3Luc and HIV-1ⅢB

3 討論

目前，抗HIV-1藥物的體外篩選主要采用細(xì)胞和分子模型進(jìn)行，構(gòu)建一個(gè)穩(wěn)定的HIV-1藥物篩選模型，是藥物研發(fā)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來，假病毒技術(shù)在抗HIV-1藥物研發(fā)和治療方面的應(yīng)用有了很大發(fā)展［19，26－27］。由于HIV-1假病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的很多環(huán)節(jié)與活病毒相同，因此被越來越多地應(yīng)用于抗HIV-1藥物的篩選及藥物抗病毒效果的評(píng)價(jià)［26，28］。已有不少研究者利用HIV-1假病毒，在細(xì)胞水平進(jìn)行抗HIV-1藥物的篩選和對(duì)患者體內(nèi)HIV-1毒株進(jìn)行耐藥性分析，并且取得了較好的效果［21，29］。

對(duì)于含VSV外殼的假病毒來說，宿主范圍很廣，能感染VSV的細(xì)胞都能感染此類假病毒。很多文獻(xiàn)［12，15］報(bào)道，VS-VG/HIV-1NL4-3Luc的宿主細(xì)胞可以是293T、HeLa、TZM-bl、A549、Jurkat C和Ghost等細(xì)胞。我們通過比較假病毒在293T、HeLa、Vero和CRFK 4種細(xì)胞上的感染性，發(fā)現(xiàn)CRFK 對(duì)VSVG/HIV-1NL4-3Luc最敏感，所以選擇CRFK作為我們的宿主細(xì)胞。關(guān)于報(bào)告基因的選擇，大多數(shù)假病毒系統(tǒng)都采用熒光素酶基因（Luciferase）或綠色熒光蛋白基因（GFP），如果選擇帶有GFP的質(zhì)粒包裝假病毒，結(jié)果需在熒光顯微鏡下或流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，費(fèi)用較高，而帶Luciferase的假病毒通過讀值可以定量得到結(jié)果，方便高效。在篩選程序上，通過與傳統(tǒng)的篩選方法進(jìn)行比較，并用不同類型陽性藥物進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)第3種方案最優(yōu)。

本研究成功地包裝出了VSVG/HIV-1NL4-3Luc假病毒，并對(duì)其各種實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了抗HIV-1藥物假病毒篩選系統(tǒng)，與活病毒相比其具有較高的生物安全性，適用于普通實(shí)驗(yàn)室對(duì)于抗HIV-1藥物研究的需求。在此模型中，不同稀釋度的假病毒感染CRFK細(xì)胞后，熒光素酶的表達(dá)水平與病毒稀釋度呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)，可以靈敏快捷的體現(xiàn)HIV-1的復(fù)制水平，并以此來研究藥物抑制試驗(yàn)，計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度，其特點(diǎn)符合藥理篩選模型的要求。而對(duì)各類型陽性藥物進(jìn)行檢測后，表明該模型對(duì)篩選NNRTI、NRTI和INI具有可行性和有效性，但不能用于篩選蛋白酶抑制劑和進(jìn)入抑制劑。不能檢測進(jìn)入抑制劑是由于假病毒采用了VSVG包膜，病毒采用不同于HIV的侵入機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞，不涉及HIV受體與輔助受體的參與及融合過程，因此該體系不適用HIV-1進(jìn)入抑制劑的篩選。此外，假病毒中熒光素酶報(bào)告基因在病毒RNA轉(zhuǎn)錄后即進(jìn)行表達(dá)，而病毒復(fù)制的晚期步驟，如病毒粒子的包裝和出芽均發(fā)生在報(bào)告基因的表達(dá)之后，故通過檢測報(bào)告基因的表達(dá)水平不能反映藥物對(duì)病毒復(fù)制晚期步驟的抑制情況，所以該方法不適用于蛋白酶等晚期步驟的抑制劑的活性篩選。有文獻(xiàn)報(bào)道［30］，可以在包裝病毒時(shí)即加入蛋白酶抑制劑進(jìn)行活性篩選，該方法效果如何還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

天然化合物具有結(jié)構(gòu)多樣性、毒副作用小、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，目前具有抗HIV活性的化合物［25，31］不斷被發(fā)現(xiàn)。VS-VG/HIV-1NL4-3Luc藥物篩選方法的條件優(yōu)化及應(yīng)用對(duì)于篩選并進(jìn)一步研發(fā)抗HIV-1藥物具有重要的意義。該模型簡單方便，但也存在不足之處，只能用于檢測病毒侵入后的復(fù)制早期階段，且轉(zhuǎn)染效率容易受各方面條件的影響［32］?？傊?，VSVG/HIV-1NL4-3Luc假病毒藥物篩選系統(tǒng)具有廣泛的研究前景，特別是在用于篩選新的抗HIV化合物方面具有重要意義。隨著假病毒體系的不斷改良，相信其技術(shù)將越來越成熟，應(yīng)用領(lǐng)域會(huì)越來越寬。

（致謝：本文實(shí)驗(yàn)在中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所分子免疫藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，在此對(duì)實(shí)驗(yàn)室成員的幫助與指導(dǎo)表示衷心的感謝！）

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Optimization and application of VSVG/HIV-1NL4-3Luc system for screening of anti-HIV-1 compounds

WANG Ping1，2，CHEN Huan2，3，LUO Rong-Hua2，QING Chen1，ZHANG Gao-Hong2，ZHENG Yong-Tang2
（1.School of Pharmaceutical Science＆Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products，Kunming Medical University，Kunming 650500，China；2.Key Laboratory of Animal Models and Human Disease Mechanisms of Chinese Academy of Science＆Yunnan Province，Kunming Institute of Zoology，Chinese Academy of Sciences，Kunming 650223，China；3.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100039，China）

Aim To establish and optimize the VSVG/HIV-1NL4-3Luc pseudovirus model for anti-HIV drugs screening.Methods The infectivity of VSVG/HIV-1NL4-3Luc in 4 different cell lines was investigated according to the method of the lucifer-ase activity analysis system of Promega company.3 different ex-perimental settings were used to detect the activities of approved anti-HIV drugs to confirm the feasibility and effectiveness of the system.Finally，some potential compounds were screened for their anti-HIV activities，and their antiviral activities against the pseudovirus were compared with HIV-1ⅢB.Results The pseud-ovirus showed the strongest replication ability in CRFK cells，and a clear dose-effect relationship was found between the report gene expression level and the virus quantity.Comparing the EC50of different positive inhibitors against VSVG/HIV-1NL4-3Luc on 3 kinds of experimental conditions，3rd scheme is the best.Finally，the system was used to screen compounds，the EC50s a-gainst pseudovirus were similar to those in HIV-1ⅢB.Conclusion An optimized VSVG/HIV-1NL4-3Luc anti-HIV screening sys-tem has been successfully developed.

VSVG/HIV-1NL4-3Luc；HIV；drug screening；posi-tive drugs；optimization；application

時(shí)間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.052.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.026

A

1001－1978（2016）03－0433－06

R329.24；R373.9；R394.2；R965.1；R978.7

2015－10－26，

2015－11－28

國家科技重大專項(xiàng)課題（No 2009ZX09501-029、2014ZX 10005-002）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81471620、81102483）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃（No 2015FB182）

王 萍（1991－），女，碩士生，研究方向：抗HIV藥物藥效學(xué)，Tel：0811-65126855，E-mail：pingwang1991＠126.com；張高紅（1977－），女，博士，研究方向：抗HIV藥物藥效學(xué)，通訊作者，E-mail：zhanggh＠m(xù)ail.kiz.ac.cn；鄭永唐（1962－），男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：艾滋病免疫學(xué)和抗HIV藥物，Tel：0811-65195684，E-mail：zhengyt＠m(xù)ail.kiz.ac.cn