TRPV1通道異源表達體系的建立和功能的初步研究

李文蘭，王德鳳，周海玉，詹紅丹，戴逸飛，周煒煒，戴 麗，隋 峰，霍海如

（1.哈爾濱商業大學生命科學與環境科學研究中心，黑龍江哈爾濱 150076；2.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100070）

TRPV1通道異源表達體系的建立和功能的初步研究

李文蘭1，王德鳳1，周海玉2，詹紅丹2，戴逸飛2，周煒煒2，戴 麗2，隋 峰2，霍海如2

（1.哈爾濱商業大學生命科學與環境科學研究中心，黑龍江哈爾濱 150076；2.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100070）

目的 構建能夠表達TRPV1通道用于實驗研究的HEK 293T細胞表達體系。方法 采用脂質體轉染方式將TRPV1質粒轉入人胚胎腎HEK 293T細胞，建立TRPV1型通道瞬時異源表達體系，并對轉染后的TRPV1表達體系進行了鑒定，同時對該通道功能特性進行了研究。結果 經熒光顯微鏡觀察，轉染率可達40％～50％；Western Blot研究發現轉染后的HEK 293T細胞在與TRPV1通道蛋白相應的位置上具有明顯的條帶，提示TRPV1通道蛋白在轉染后的細胞中有異源性表達；共聚焦顯微成像顯示，轉染后的HEK 293T細胞在受到TRPV1通道激動劑刺激后，胞內熒光強度明顯變強，提示TRPV1通道介導鈣離子功能正常。結論

研究結果表明，基于HEK 293T細胞的TRPV1通道瞬時轉染的異源表達體系成功構建。

瞬時轉染；TRPV1通道；HEK 293T細胞；異源性表達；背根神經節；基因轉染

TRPV1通道又被稱為辣椒素受體，是瞬變感受器電位離子通道蛋白（transient receptor potential ion channel pro-tein，TRP）家族中的第一個被發現和克隆的成員，由432個氨基酸組成，也是目前研究得最多的TRP家族成員之一［1－2］。TRPV1通道組織分布廣泛，表達于背根神經節和三叉神經節的小型神經元等外周感覺神經元以及上皮、表皮以及角質細胞等組織中。其功能復雜、配體多樣，可被辣椒素、樹膠脂毒素（RTX）、炎性介質（如花生四烯酸代謝物）、組織損傷刺激物等激活［3］。另外，熱（＞43℃）、酸（pH＜5.3）、細胞外滲透壓的改變、細胞內、胞內氧化還原狀態等均可敏化或激活該通道［4］。現已明確，TRPV1通道與炎癥、疼痛等多種病癥相關，近年已成為醫藥界研究的熱點［5］。但限于該通道的表達主要在外周感覺神經元，原代取材繁瑣，操作精細，很難獲得一定量的高純度和活度的表達TRPV1受體的原位細胞。因此本研究以人胚胎腎細胞HEK 293T細胞為載體，通過瞬時轉染的方式構建TRPV1通道的異源性表達載體，為進一步探討TRPV1通道的功能及其分子機制，以及進一步篩選出高選擇性激動劑或抑制劑打下技術和方法學基礎。

1 材料

1.1 細胞與試劑 HEK 293T細胞，中國醫學科學院基礎醫學研究所。TRPV1質粒DNA和脂質體轉染試劑Lipo-fectamin 2000，廣州復能基因公司；DMEM培養基和新生牛血清，美國Gibco公司；質粒大提試劑盒，美國Omega公司；TRPV1多克隆抗體和羊抗兔IgG，武漢博士德公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2 主要儀器 TE 2000-U熒光顯微鏡，日本NIKON公司；HT-300電泳儀，北京鴻濤基業科技發展有限責任公司；共聚焦顯微成像系統為日本奧林巴斯，OLYMPUS公司產品；HE-RA Cell 150i二氧化碳培養箱，美國Thermo Scientific公司；醫用凈化工作臺，北京半導體設備一廠；BDS 260電熱三用水箱，北京醫療設備廠。

2 方法

2.1 質粒的抽提與細胞轉染 將質粒DNA轉化至DH5α感受態大腸桿菌中，接種到含100 mg·L－1氨芐青霉素（Amp）的LB平板上，將平板倒置于37℃恒溫培養箱過夜。挑取單個菌落于含100 mg·L－1Amp的LB液體培養基，180 r·min－1，37℃過夜培養。使用試劑盒進行DNA的抽提。轉染前24 h細胞接種于35 mm2平皿，細胞融合至約50％時使用脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000進行轉染，每皿加質粒2 μg與脂質體4 μL。6 h后將含脂質體的培養基換成含100 mL·L－1新生牛血清、無抗生素的DMEM培養基，24 h后倒置熒光顯微鏡觀察［6］。

2.3 Western blot檢測蛋白表達 轉染后24 h，用三去污裂解液提取轉染細胞的總蛋白，測定濃度并分裝，分別取總蛋白20 μg和40 μg與5×SDS上樣緩沖液混合，進行80 g· L－1的SDS-PAGE電泳，隨后電轉至PVDF膜上，用含50 g· L－1脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1.5 h。用TRPV1多克隆一抗（1∶200）4℃孵育過夜。用辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG（1∶1 500）室溫孵育1 h，隨后進行顯影［7］。

2.4 共聚焦顯微成像 細胞轉染后24 h，將細胞用質量分數為2.5 g·L－1胰酶消化，接種于事先用多聚賴氨酸處理過的共聚焦專用皿上，將培養皿放在激光共聚焦顯微鏡的載物臺上，選定熒光顯色好的細胞視野，再用氬離子激光預掃描，再根據預掃描的結果選取最清晰的焦平面進行掃描，然后隨機圈定細胞，進行動態觀察，同步記錄背景熒光值。記錄每個細胞的熒光強度變化并隨機軟件自動分析，細胞內［Ca2＋］i濃度變化以熒光強度值（intensity）表示，此數值與細胞［Ca2＋］i變化呈正相關。所有試劑在有效劑量范圍內都經證明不產生熒光干擾，染色條件和激光掃描參數在整個實驗中不變［8－9］。

3 結果

3.1 熒光顯微鏡觀察 轉染HEK 293T細胞24 h后，熒光顯微鏡觀察結果顯示，在轉染的HEK 293T細胞中有熒光蛋白的表達，可以認為該目的基因已成功轉入細胞，見Fig 1。

Fig 1 Fluorescence site indicates transfected HEK 293T cells（200×）

3.2 TRPV1通道異源表達體系的蛋白印跡鑒定 以DRG神經組織為陽性對照，以未轉染TRPV1通道的HEK 293T細胞為陰性對照（HEK 293T－），上樣量40 μg，進行了蛋白印跡檢測分析，結果表明，轉染后的HEK 293T細胞（HEK 293T＋）在100 ku左右處有一清晰條帶，而空白對照組不具備此條帶，如Fig 2所示，蛋白印跡實驗表明質粒轉染成功。

Fig 2 SDS PAGE for TRPV1 channel protein

3.3 HEK 293T細胞異源性表達的TRPV1通道的功能TRPV1通道激動劑辣椒素（2 μmol·L－1）給藥后，共聚焦顯微鏡下可見，TRPV1通道轉染成功的HEK 293T細胞胞內熒光強度逐漸變強，約20 s后到達到熒光強度的最高點，然后開始下降，至給藥后的150 s左右熒光強度回到給藥前的狀態（Fig 3）。沒有轉染TRPV1基因的HEK 293T細胞在受到辣椒素刺激后，胞內的熒光強度未見明顯變化（Fig 4）。以上的研究結果提示，轉染后的TRPV1通道介導鈣離子的功能正常，能夠通過胞內鈣信號的變化執行特定的生物學效應。

Fig 3 Changing curves of intracellular fluorescence of HEK 293T＋cells post-stimulation by TRPV1 agonist

Fig 4 Changing curves of intracellular fluorescence of HEK 293T－cells post-stimulated by TRPV1 agonist

4 討論

TRPV1是目前研究最多、機制較為清楚的TRPV亞家族成員之一，主要存在于背根神經節（DRG）和三叉神經節的較小直徑細胞中［10］。近年研究表明，TRPV1通道在痛覺的產生及痛覺敏感性增強的病理發生過程中扮演著重要角色［11］。基于此，TRPV1通道業已成為止痛新藥研究的新的關注藥靶。有關TRPV1通道的研究，傳統的方式是通過分離大鼠的背根神經節，純化后獲得一定純度表達有一定豐度TRPV1通道的DRG神經元，我們由于實驗需要，前期建立了表達TRPV1通道原代培養體系，但該方法操作繁雜、工作量大，且較難獲得高純度和高活度的神經元，不適于藥物的廣泛篩選研究［12］。因此，本研究通過基因轉染的方式，建立了TRPV1通道的異源表達體系。研究結果顯示，在HEK 293T細胞上轉染TRPV1通道轉染率高、蛋白表達豐度高，且功能活性良好。利用該TRPV1的異源表達體系，系統地開展TRPV1通道激動劑或阻斷劑的篩選研究，或利用該體系，對其調控和功能做進一步研究，將有助于更深入地了解TR-PV1通道的功能特性，為尋找特異性的TRPV1通道功能調節相關藥物奠定了基礎。

（致謝：本實驗在中國中醫科學院中藥研究所中藥理論與本草文獻研究中心實驗室由李文蘭、王德鳳、周海玉、詹紅丹、戴逸飛、周煒煒、戴麗、隋峰和霍海如等共同參與完成。）

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Construction and preliminary functional study of heterologous expression system of TRPV1 channel

LI Wen-lan1，WANG De-feng1，ZHOU Hai-yu2，ZHAN Hong-dan2，DAI Yi-fei2，ZHOU Wei-wei2，DAI Li2，SUI Feng2，HUO Hai-ru2
（1.Research Center on Life Sciences and Environmental Sciences，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；2.Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

Aim The TRPV1 plasmid was transiently transfected into human embryonic kidney HEK 293T cells to establish the heterologous expression system of TRPV1-channel.Methods The transfection efficiency was confirmed under fluorescence mi-croscope and the TRPV1 protein expression was identified by u-sing Western blot，and the functional characteristics of the chan-nel were studied by using the method of confocal microscopy.Results The transfection rate could reach 40％～50％；the transfected cells were found to have a clear band at the corre-sponding position that TRPV1 should be，which indicated that TRPV1 channel protein was expressed in the transfected cells.The confocal microscopy imaging result showed that the trans-fected HEK 293T cells were activated by TRPV1 channel ago-nist.Conclusion Transient transfection of HEK 293T cells with TRPV1 channel is successfully constructed and the heterol-ogous TRPV1 channel is verified to have normal calcium-media-ting function.

transient transfection；TRPV1 channel；HEK 293T cells；heterologous expression；dorsal root ganglion；gene trans-fection

時間：2016－2－26 10：20 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.054.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.027

A

1001－1978（2016）03－0439－03

R322.61；R341；R392.11；R394.2；R977.6

2015－10－08，

2015－12－07

國家自然科學基金面上項目（No 81274112，81373986，81473372）；國家自然科學基金青年項目（No 81403125，81403322）；北京市自然科學基金（No 7152106）

李文蘭（1967－），女，博士，教授，研究方向：中藥藥效物質基礎，E-mail：lwldzd＠163.com；隋 峰（1967－），男，博士，研究員，研究方向：中藥藥性和藥理學，通訊作者，E-mail：suifeng2136＠126.com；霍海如（1960－），女，博士，研究員，研究方向：中藥藥理和藥性，E-mail：hairuh＠icmm.ac.com

◇研究簡報◇