染料木素磺酸鈉對腦缺血再灌注損傷大鼠ATP酶活性的影響*

黎　曉，謝佳麗，賴麗娟，李玉磊，邱　平，李良東，黃志華，黃　誠

(贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西　贛州　341000)

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染料木素磺酸鈉對腦缺血再灌注損傷大鼠ATP酶活性的影響*

黎曉，謝佳麗，賴麗娟，李玉磊，邱平，李良東，黃志華，黃誠

(贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西贛州341000)

摘要:目的:觀察染料木素磺酸鈉(GSS)對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠Na+-K+-ATPase和Ca(2 +)-Mg(2 +)-ATPase活性的影響，研究其對腦缺血時能量代謝的改善作用。方法:采用大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)動物模型，Longa評分方法行神經(jīng)功能學(xué)評分，TTC染色方法測定腦梗死范圍，酶活性分析檢測技術(shù)檢測Na+-K+-ATPase和Ca(2 +)-Mg(2 +)-ATPase活性。結(jié)果: MCAO再灌注模型組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能損傷和腦梗死，缺血側(cè)腦組織Na+-K+-ATPase和Ca(2 +)-Mg(2 +)-ATPase活性降低; GSS治療后，神經(jīng)功能評分降低，腦梗死體積縮小，腦組織兩種ATPase活性均升高。結(jié)論: GSS對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，改善腦細(xì)胞能量代謝障礙是其機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞:腦缺血再灌注損傷;染料木素磺酸鈉;能量代謝

腦血管疾病是目前嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一。其以高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率及高復(fù)發(fā)率嚴(yán)重影響人類的健康。腦缺血再灌注損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，腦血流中斷和再灌注使腦細(xì)胞產(chǎn)生損傷是一個快速的級聯(lián)反應(yīng)，這個級聯(lián)反應(yīng)包括許多環(huán)節(jié)，如腦能量障礙、細(xì)胞酸中毒、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)、自由基損傷、炎癥細(xì)胞因子損害及凋亡基因激活等［1］。目前治療腦梗死的藥物主要有抗血小板凝集藥物、抗凝劑、溶栓藥、血管擴(kuò)張劑、神經(jīng)營養(yǎng)藥物等。然而，療效顯著、不良反應(yīng)小、從多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)發(fā)揮作用的治療腦梗死及改善患者預(yù)后的藥物仍十分稀少。研究表明，雌激素具有很好的腦保護(hù)作用［2］，植物雌激素具有弱雌激素作用的同時能減少雌激素帶來的一系列不良反應(yīng)，因此在臨床應(yīng)用方面具有廣闊的前景。染料木素磺酸鈉(genistein sodium sulfonate，GSS)，是由染料木素(一種植物雌激素)進(jìn)行磺化合成，為強(qiáng)水溶性化合物。前期研究表明，GSS對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用［3］，然而，其保護(hù)機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用大腦中動脈栓塞(middle artery occlusion，MCAO)所致的局灶性腦缺血再灌注損傷模型，觀察GSS對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠Na+-K+-ATPase和Ca2 +-Mg2 +-ATPase活性的影響，研究其對腦缺血時能量代謝的改善作用。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1實(shí)驗(yàn)動物雄性SD大鼠，體重250～280 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司(動物中心許可證號: SCXK(湘) 2011－0003，動物合格證號: 43004700003244，級別: SPF級)。

1．1．2主要試劑染料木素磺酸鈉(C15H10O8SNa)購自上海習(xí)氏化工有限公司，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-tripheyltetrazolium，TTC) (貨號: T8877 －25G )購自Sigma公司;超微量Na+-K+-ATPase 和Ca2 +-Mg2 +-ATPase檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所(貨號: A070－6，批號: 201220423)。

1．2實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的制備

參照Longa等［4］的方法制備大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌注模型，即局灶性腦缺血再灌注損傷模型。SPF級SD大鼠，雄性，體重250～280 g，大鼠用10%水合氯醛溶液(350 mg·kg－1，ip)麻醉，作頸部正中切口，分離頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，于向心端夾閉頸總動脈、遠(yuǎn)心端夾閉頸內(nèi)動脈，于頸外動脈切口，將一尼龍線(長4 cm，線體直徑0．26 mm，頭端直徑0．36 mm)經(jīng)頸外動脈切口緩慢向頸內(nèi)動脈入顱方向推進(jìn)，以頸總動脈分叉處為標(biāo)記，推進(jìn)18～20 mm感到輕微阻力時，即達(dá)到較細(xì)大腦前動脈，阻斷大腦中動脈的所有血液供應(yīng)，2 h后，拔出尼龍線至頸外動脈處，并剪去尼龍線殘端，完成腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組大鼠只暴露和分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，并結(jié)扎頸外動脈，不閉塞大腦中動脈。術(shù)中嚴(yán)格控制室溫在23℃～25℃。

1．2．2實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法將大鼠隨機(jī)分成5組:假手術(shù)組、腦缺血再灌注損傷模型組、GSS低劑量(0．5 mg·kg－1)、GSS中劑量(1 mg·kg－1)及GSS高劑量(2 mg·kg－1)治療組。藥物治療組于缺血后10 min分別從舌下靜脈注射不同劑量的GSS，假手術(shù)組和模型組給予同體積的生理鹽水。

1．2．3神經(jīng)功能評分大鼠再灌注24 h后，進(jìn)行Longa氏評分［4］，分值越高神經(jīng)功能缺陷越顯著。神經(jīng)功能行為評分標(biāo)準(zhǔn): 0分，未觀察到神經(jīng)功能缺陷癥狀; 1分，不能完全伸展手術(shù)對側(cè)前爪(輕度局灶性神經(jīng)功能缺陷) ; 2分，向手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈(中度局灶性神經(jīng)功能缺陷) ; 3分，向手術(shù)對側(cè)傾倒(重度神經(jīng)功能缺陷) ; 4分，不能自發(fā)行走，意識昏迷。

1．2．4腦梗死體積測定再灌注24 h后，大鼠麻醉后，斷頭取腦，將大腦置于大鼠腦模具中，用薄刀片沿冠狀面切成厚約2 mm腦片5片，置于0．5% TTC染色溶液中，37℃避光孵育10 min。經(jīng)染色后非缺血區(qū)呈玫瑰紅色，腦梗死區(qū)呈灰白色。將腦片置于4%多聚甲醛中固定。固定好的腦片濾紙吸干后按順序擺放，數(shù)碼相機(jī)照相，采用DT-2000圖象分析軟件測算出各切面的腦梗死面積，再根據(jù)公式計(jì)算出腦梗死體積，考慮腦水腫的影響，采用校正后的梗死體積公式［5］:校正梗死體積=測量的梗死面積×{ 1－［(同側(cè)半球面積－對側(cè)半球面積) /同側(cè)半球面積］}，各腦片梗死面積之和乘以厚度(2 mm)為總的梗死體積，將梗死體積占全腦體積的百分比進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1．2．5腦組織酶活性檢測再灌注24 h后，大鼠麻醉后。斷頭取腦，并將左側(cè)前腦于冰浴中加入生理鹽水(腦組織重量∶生理鹽水體積= 1∶9)制成10%的組織勻漿，4℃，3 500 rpm·min－1，離心10 min，取上清，于－80℃保存。嚴(yán)格按試劑盒說明，測定腦組織Na+-K+-ATPase和Ca2 +-Mg2 +-ATPase的活性。

1．2．6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用Prism 5．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各測量指標(biāo)的計(jì)量資料以±s表示，組間各測定指標(biāo)的總體比較采用單因素方差分析，組內(nèi)各指標(biāo)的多重比較采用SNK檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2．1神經(jīng)功能評分圖1所示，MCAO再灌注模型組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能損傷，1．0 mg· kg－1(P＜0．01)及2．0 mg·kg－1GSS(P＜0．05)治療后，大鼠腦缺血再灌注損24 h后神經(jīng)功能評分降低，神經(jīng)功能提高。

圖1　GSS對MCAO大鼠神經(jīng)功能評分的影響

2．2腦梗死范圍圖2及圖3所示，腦片TTC染色后正常腦組織染成紅色，損傷區(qū)染成白色，1．0 mg· kg－1(P＜0．05)及2．0 mg·kg－1GSS(P＜0．001)治療組可減小大鼠缺血再灌注24 h后腦梗死體積。提示在整體動物水平，GSS對腦缺血再灌注損傷有較好的保護(hù)作用。

圖2　GSS對大鼠腦梗死范圍的影響

圖3　GSS對大鼠腦梗死體積的影響

2．3 GSS對MCAO再灌注大鼠缺血側(cè)腦組織Na+-K+-ATPase和Ca2 +-Mg2 +-ATPase活性的影響圖4及圖5所示，MCAO模型大鼠缺血側(cè)腦組織Na+-K+-ATPase和Ca2 +-Mg2 +-ATPase的活性均降低，與假手術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01，P＜0．001) ; GSS治療后，大鼠缺血側(cè)腦組織ATPase活性升高，與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。

圖4　GSS對鈉鉀ATPase活性的影響

圖5　GSS對鈣鎂ATPase活性的影響

3　討論

腦缺血缺氧時，腦組織Na+-K+-ATPase活性降低［6］，這是由于缺血缺氧時，神經(jīng)細(xì)胞氧化磷酸化能力減弱，ATP合成減少，消耗增多，Na+-K+泵功能降低。Na+-K+-ATPase活性降低，可進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞膜對Na+和K+的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，通過以下兩個方面造成腦組織損傷。

一方面，Na+和K+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)不足可引起細(xì)胞膜靜息電位下降，激活電壓依賴性鈣通道，導(dǎo)致大量Ca2 +內(nèi)流;腦損傷后的缺血、缺氧反應(yīng)引起神經(jīng)元突觸前膜興奮性氨基酸囊泡大量破裂，釋放至突觸間隙，激活神經(jīng)元突觸后膜的NMDA受體，使受體依賴性Ca2 +通道開放，也可引起Ca2 +大量內(nèi)流。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可調(diào)節(jié)Ca2 +的攝取和釋放，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2 +穩(wěn)態(tài)，其中Ca2 +-Mg2 +-ATPase起重要作用。腦缺血時Ca2 +-Mg2 +-ATPase活性下降［7－8］，不能將Ca2 +泵入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Ca2 +在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)蓄積，形成“鈣超載”，誘發(fā)一系列病理反應(yīng)，促發(fā)和加劇繼發(fā)性腦損傷。

另一方面，腦細(xì)胞水腫是缺血后最早出現(xiàn)的形態(tài)學(xué)變化，其產(chǎn)生原因是由于膜去極化引起的過多的Na+和Ca2 +內(nèi)流。越來越多的證據(jù)表明，能量代謝不足和Na+-K+-ATPase功能障礙是缺血引起的細(xì)胞損傷的重要因素［9］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦組織缺血再灌注損傷后，Na+-K+-ATPase及Ca2 +-Mg2 +-ATPase活性降低，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致。GSS治療后，兩種ATP酶活性均升高，提示GSS可通過改善缺血腦組織能量代謝，進(jìn)而減輕腦細(xì)胞水腫及“鈣超載”起腦保護(hù)作用。

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Effects of Genistein Sodium Sulfonate(GSS) on ATPase Activities of Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

LI Xiao，XIE Jia-li，LAI Li-juan，LI Yu-lei，QIU Ping，LI Liang-dong，HUANG Zhi-hua，HUANG Cheng
(Basic Medical School of Gannan Medical Universty，Ganzhou，Jiangxi 341000)

Abstract:Objective: To investigate the effects of genistein sodium sulfonate (GSS) on the activities of Na+-K+-ATPase and Ca(2 +)-Mg(2 +)-ATPase in cerebral ischemia/reperfusion rat and explore its improvement effect on energy metabolism．

Key words:cerebral ischemia/reperfusion injury; genistein sodium sulfonate; energy metabolism

(收稿日期:2015－11－25) (責(zé)任編輯:敖慧斌) 2015－10－08) (責(zé)任編輯:敖慧斌)

通訊作者:黃志華，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事心腦血管疾病研究。E-mail: gnyxyhzh@163．com

*基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NO．31360250) ;江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NO．20114BAB205078) ;江西省教育廳科技項(xiàng)目(NO．GJJ12554) ;江西省衛(wèi)生廳科技項(xiàng)目(NO．20121094)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．002

中圖分類號:R285．5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－5779(2016) 01－0009－04

Methods: A rat cerebral ischemia/reperfusion injury was made through embolization of the middle cerebral artery．The neurological score was valued by using Longa grading method．The cerebral tissue was stained by using the TTC method，and the volume of infarction was investigated．The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2 +-Mg2 +-ATPase in brain tissue were measured by using Enzyme activity analysis assay．Results: MCAO model rats showed significant injury in neurological function and infarction volume，and reductions in the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2 +-Mg2 +-ATPase．After treated with GSS，the neurological score and volume of infarction were decreased，while the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2 +-Mg2 +-ATPase were increased．Conclusion: GSS has certain therapeutic effects on cerebral ischemia/reperfusion injury because it enhances brain energy metabolism．