大鼠局灶性腦缺血再灌注后海馬CA1區TASK-1表達及其與星形膠質細胞活化的關系

袁建清，鐘善全，劉　錚，廖春英

(贛南醫學院第一附屬醫院神經內科，江西　贛州　341000)

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大鼠局灶性腦缺血再灌注后海馬CA1區TASK-1表達及其與星形膠質細胞活化的關系

袁建清，鐘善全，劉錚，廖春英

(贛南醫學院第一附屬醫院神經內科，江西贛州341000)

摘要:目的:觀察一種新型雙孔鉀離子通道亞單元TASK-1在大鼠海馬CA1區的表達及其在局灶腦缺血再灌注后的動態變化，探討TASK-1表達與星形膠質細胞活化的關系。方法:建立大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)再灌注模型，采用免疫熒光組化和激光掃描共聚焦觀察大鼠MCAO再灌注后3、7、28 d海馬CA1區TASK-1和GFAP表達。結果:成年大鼠海馬CA1區可見大量TASK-1和GFAP雙標陽性的細胞，MCAO再灌注后3、7、28 d海馬CA1 區TASK-1和GFAP表達逐步上調，與假手術組比較均有顯著差異(P＜0．05)。結論:腦缺血再灌注后大鼠海馬CA1區TASK-1的表達上調與星形膠質細胞的活化有一定關系。

關鍵詞:TASK-1通道;星形膠質細胞;海馬CA1區;腦缺血

星形膠質細胞在腦缺血病理過程中起重要作用，在缺血后不同時程，增殖活化不同，有保護或加重神經元損傷的功能［1－2］。有研究［3－5］表明，雙孔鉀通道TASK-1表達背景或泄漏K電流，形成細胞膜靜息電位，調節細胞的興奮性，可能參與腦缺血后星形膠質細胞神經保護作用。腦缺血后大鼠海馬TASK-1表達情況及與星形膠質細胞活化、增殖的關系國內外尚少見報道。本研究觀察大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)后大鼠海馬CA1區TASK-1的表達變化，探討其與星形膠質細胞活化的關系，為探索腦缺血治療的新的作用靶點提供實驗依據。

1　材料與方法

1．1材料成年(3月齡)健康雄性Wistar大鼠24只，體質量250～300 g，由贛南醫學院動物實驗中心提供。兔抗TASK-1購于以色列Alomone Labs公司，小鼠抗膠質纖維酸性蛋白(GFAP)購于美國Neomarkers公司，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗小鼠IgG、花青素(Cy3)標記的驢抗兔IgG、普通小牛血清、普通羊血清和普通驢血清均購于美國Jackson Immuno Research公司，恒冷切片機(德國Leica公司CM1900型)，激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司FV500型)。

1．2 MCAO制備及分組應用線栓法建立MCAO［6］模型。將實驗大鼠隨機分為4組，分別為假手術(sham)、MCAO 3 d、MCAO 7 d、MCAO 28 d組，每組6只。術前12 h禁食，自由進水。用6%水合氯醛麻醉(300 mg·kg－1體質量)，術中維持動物直腸溫度(36．6±0．5)℃。分離并結扎右側頸總動脈、頸外動脈，注意避免刺激迷走神經。于頸總動脈近頸內動脈、頸外動脈分叉處剪一小口，插入一前端5 mm涂以硅膠的4-0絲線進入頸內動脈，深度為距離頸總動脈分叉處1．8～2．0 cm，1 h后拔出絲線進行再灌注。按Longa［6］等神經功能評分1～3分者入選MCAO 3 d、MCAO 7 d、MCAO 28 d組。假手術組除不插線栓外余步驟同上，并于24 h后取材。術后在約20℃的空調環境下單籠飼養，自由進水、進食。

1．3熒光免疫組化法檢測大鼠缺血后海馬CA1區TASK-1和GFAP的表達造模后的各組大鼠快速斷頭取腦，將腦組織置于－80℃冷凍保存。－20℃恒冷切片機自視交叉處開始，行10 μm厚連續冠狀切片。冰凍切片置4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中(4℃)固定15 min，PBS振蕩清洗3次，每次5 min，滴加3%普通驢血清(NDS/PBS)封閉液封閉2 h，棄血清，滴加兔抗TASK-1(1∶200)、小鼠抗GFAP(1 ∶200)，對照組不加一抗，4℃孵育過夜; PBS振蕩清洗3次，每次5 min，滴加羊抗小鼠FITC(1∶200)和驢抗兔Cy3(1∶200)，室溫避光孵育1 h，流水沖洗40 min后，50%甘油封片。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，激發/發射波長為550/565 nm的CY3呈紅色熒光，表示TASK-1蛋白;激發/發射波長為488/525 nm的FITC呈綠色熒光，表示星形膠質細胞染色;雙標陽性的星形膠質細胞為黃色。通過image pro-plus軟件(version 6．0)來測定各組雙標陽性細胞的積分光密度(IOD)值。

1．4統計學方法采用SPSS 13．0統計軟件。計量數據以±s表示，組間比較采用方差分析，P＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

GFAP是星形膠質細胞特異性標志物，呈綠色熒光，TASK-1呈紅色熒光，雙標陽性的細胞呈黃色。在大鼠海馬CA1區可見形態正常呈樹根狀或放射狀的綠色熒光的星形膠質細胞(GFAP陽性)，MCAO再灌注后，星形膠質細胞增生肥大呈活化狀態，缺血再灌注后3、7、28 d可見TASK-1和GFAP表達逐漸增強(見圖1)。Sham、MCAO 3 d、MCAO 7 d和MCAO 28 d組海馬CA1區雙標陽性細胞的IOD值(×106)分別為: 1．14±0．21，2．14±0．24，2．72± 0．40和4．08±0．60，Sham組與其他三組比較，P均＜0．05; MCAO 28 d組與MCAO 3 d、MCAO 7 d組比較，P＜0．05。

圖1　MCAO再灌注后TASK-1和GFAP在海馬CA1區表達變化(×400)

3　討論

雙孔鉀離子通道(K2P，KCNK)是近年來發現的一類新型鉀離子通道，具有6個跨膜結構(6TMS)和2個孔道結構(2P)［4］，對經典的鉀通道阻滯劑如四已基胺、4-氨基吡啶等不敏感，但能被體內外眾多病理生理因子及化學、機械刺激所調控［7－8］，包括多聚不飽和脂肪酸、神經遞質、溶血磷脂酸、第二信使、揮發性麻醉劑，還有細胞內外的pH值、滲透壓、氧分壓的改變、溫度變化及機械牽張等。K2P表達具有線性I－V關系的背景K電流［4］，在細胞膜電位的復極化和膜靜息電位的形成中起重要作用，并能穩定膜電位，調節細胞的興奮性［4］。通過鼠類中樞神經系統K2P基因原位雜交研究顯示，在所有的雙孔鉀離子通道亞型中，有7種表達于成年鼠類的中樞神經系統，包括TASK-1、TASK-3、TWIK-1、THIK-1、TRAAK、TREK-1和TREK-2［8－11］。

TASK-1是雙孔鉀離子通道的一種亞型，通過TASK-1基因敲除的小鼠研究表明，TASK-1在腦缺血中可能起著腦保護作用，TASK-1－/－的小鼠對腦缺血損傷的敏感性明顯增加［12－13］，腦梗死的面積明顯增大。腦缺血是一種致死率、致殘率極高的常見病。近年來對其研究一直集中于神經元，但迄今尚無有效根治措施。現國內外許多研究表明，星形膠質細胞在腦缺血病理過程中起重要作用，在缺血后不同時程，增殖活化不同，具有保護或加重神經元損傷的不同功能［14－15］。星形膠質細胞的神經保護作用依賴于其表達特征性的具有線性I－V關系的被動電傳導，且具有低的膜電位(－75 mV)及低的膜電阻［16］。有研究表明TASK-1和TREK-1功能性表達于海馬區成熟的星形膠質細胞，是其特征電傳導的通道基礎，并認為腦缺血時所產生的損傷因子可能通過作用于星型膠質細胞K2P來影響膠質細胞的活化增殖及緩沖功能，從而影響神經元的命運［17－18］。

本研究中發現，大鼠海馬CA1區星形膠質細胞表達TASK-1通道蛋白，MCAO再灌注后，其表達逐步上調且與星形膠質細胞的活化有一定關系。因此推測，腦缺血時所產生的損傷因子可能通過作用于星形膠質細胞上表達的K2P來影響膠質細胞的電生理特性、平衡緩沖功能及活化增殖，進而影響神經元的命運，從而可能成為今后缺血性腦卒中治療的潛在靶點。

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Changes in TASK-1 Expression and Its Involvement in Astrogliosis Following Cerebral Ischemia in Rat CA1 region of Hippocampus

YUAN Jian-qing，ZHONGg Shan-quan，LIU Zheng，LIAO Chun-ying
(Dept．of Neurology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000)

Abstract:Objective: To investigate changes in TASK-1 expression and its involvement in astrogliosis following cerebral ischemia in rat CA1 region of hippocampus．Methods: Focal ischemia was induced by temporary middle cerebral artery occlusion (MCAO)．The experimental rats induced by MCAO were sacrificed on days 3，7 and 28 after reperfusion．The expressions of TASK-1 and GFAP on astrocytes in the CA1 region of Hippocampus were detected by immunofluorescence and confocal microscope．Results: TASK-1 was broadly expressed on astrocytes in the CA1 region of hippocampus．After MCAO，the expressions of bothTASK-1 and GFAP on astrocytes were significantly increased at days 3，7，28 following reperfusion．Conclusion: After MCAO，the increased TASK-1 expression on astrocytes in rat CA1 region of hippocampus is related with astrocyte activation．

Key words:TASK-1 channel; Astrocyte; CA1 region of Hippocampus; Cerebral ischemia

(收稿日期:2015－11－02 ) (責任編輯:敖慧斌)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．006

中圖分類號:R743

文獻標志碼:A

文章編號:1001－5779(2016) 01－0024－03