六月雪水提取物體外清除羥自由基活性的實驗研究*

李洪亮，周　漫，丁冶春，范小娜

(贛南醫學院1．藥學院; 2．科研處，江西　贛州　341000)

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六月雪水提取物體外清除羥自由基活性的實驗研究*

李洪亮1，周漫1，丁冶春1，范小娜2

(贛南醫學院1．藥學院; 2．科研處，江西贛州341000)

摘要:目的:探討六月雪水提取物體外清除羥自由基活性，證明六月雪水提取物胃黏膜損傷的保護作用是否與清除自由基有關。方法:基于抗壞血酸還原Cu(2 +)為Cu+，Cu+還原H2O2形成羥自由基·OH，·OH氧化鄰菲羅啉，使其處于激發態，退激發時發光?？寡趸瘎┛梢郧宄H，可以減少激發態鄰菲羅啉的產生，使發光強度降低，運用此技術檢測六月雪水提取物體外清除羥自由基的能力。結果:在六月雪水提取物的原濃度(3 000．000 mg·mL(－1))時，羥自由基被清除了98．978%，隨著六月雪水提取物溶液的稀釋，其清除羥自由基的能力逐漸降低，當稀釋為原濃度的1/16 384濃度(0．183 mg·mL(－1))時，六月雪水提取物溶液清除羥自由基的能力與空白組比較接近。結論:六月雪水提取物具有良好的體外清除羥自由基活性的能力，隨著六月雪水提取物溶液的稀釋，其清除羥自由基的能力逐漸降低。

關鍵詞:六月雪水提取物;羥自由基;鄰苯三酚

六月雪Serissa Serissoides(DC．) Druce(SSD)來源于茜草科植物小灌木白馬骨的全草或根，主要含有揮發油類、甾體類、萜類以及糖類等化學成分;其性涼、味苦、微辛，歸肺、脾、肝、胃經［1］。具有疏風利濕、清熱解毒的功效，臨床上主要用于時行感冒，咳嗽咽痛，牙齦腫痛，目赤腫痛，濕熱黃疸，暑濕瀉痢，淋濁帶下，風濕關節痛，歷節風痛，跌打損傷以及癰疽腫毒，瘰疬惡瘡等癥［2］。本課題組主要針對胃黏膜損傷的保護作用通過無水乙醇法、阿司匹林法、水浸應激法及利血平法實驗小鼠胃黏膜損傷動物模型，測定給藥后胃黏膜損傷面積，結果證明六月雪對胃黏膜損傷具有保護作用［3］。在對無水乙醇胃飼誘發急性胃黏膜損傷的動物模型考察研究中發現，六月雪提取物對實驗性胃黏膜損傷具有顯著的修復作用［4］。為了進一步研究探討六月雪對實驗性胃黏膜損傷保護作用機制，本文重點觀察六月雪水提取物體外清除羥自由基活性的研究，以判斷六月雪對胃黏膜損傷的保護作用是否與清除自由基有關。

1　儀器與試劑

BPCL-1-G-C微弱發光測量儀(中國科學院北京生物物理研究所) ;鄰苯三酚，江西洪都化學制劑廠; 3-氨基鄰苯二甲酰肼(luminol)，Sigma公司;乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，上?；瘜W試劑總廠;其他試劑均為分析純。

2　清除羥自由基(·OH)實驗

2．1試液配制本實驗采用鄰菲羅啉-Cu2 +-抗壞血酸-H2O2體系。

CuSO4溶液: 124．8 mg CuSO4·5H2O溶于雙蒸水至500 mL。

PBS(pH 6．2)溶液: 0．2 mol·L－1NaH2PO4溶液81．5 mL和0．2 mol·L－1Na2HPO4溶液18．5 mL混合后加雙蒸水稀釋至400 mL。

鄰菲羅啉溶液: 19．6 mg鄰菲羅啉溶于PBS(pH 6．2)溶液至100 mL。

Vc溶液: 17．6 mg Vc溶于PBS(pH 6．2)溶液至100 mL。

0．15%H2O2溶液: 30% H2O2溶液加入雙蒸水稀釋至0．15%。

BBS(pH 9．0)溶液: 0．05 mol·L－1Na2B4O7· 10H2O溶液80 mL和0．2 mol·L－1H3BO3溶液20 mL混合。

2．2·OH的產生與清除本反應的原理以Fenton反應為基礎［5］，抗壞血酸還原Cu2 +為Cu+，Cu+還原H2O2形成羥自由基·OH，·OH氧化鄰菲羅啉，使其處于激發態，退激發時發光?？寡趸瘎┛梢郧宄H，·OH對多元酚類成分主要是脫氫反應而被還原，因此可以減少激發態鄰菲羅啉的產生，所以發光強度降低。操作步驟為，在發光杯中加入50 μL樣品溶液(以相同量的蒸餾水作空白對照)、50 μL CuSO4溶液、20 μL Vc溶液、50 μL鄰菲羅啉溶液和50 μL 0．15% H2O2溶液，再加入BBS溶液780 μL啟動反應，記錄發光強度(Chemical Luminescence，CL)。CL值以峰高計算，根據CL大小可以判斷物質清除·OH的能力。自由基清除率用以下公式計算。

自由基清除率= (CL空白對照－CL樣品) / CL空白對照×100%

鄰菲羅啉-Cu2 +-抗壞血酸-H2O2體系的動力曲線見圖1。從該動力曲線圖可見，該反應在啟動后，將在200秒鐘左右出現最高峰，但其淬滅速度比較慢，要到1 000秒之后發光才基本結束。

圖1　鄰菲羅啉-Cu2 +-抗壞血酸-H2O2體系動態曲線

②Fenton反應，過氧化氫在Cu+作用下被還原成羥自由基(·OH)

③羥自由基(·OH)奪取還原劑的一個氫而被還原。

④剩余的·OH將鄰啡羅啉氧化為電子激發態，退激發時釋放一個光子。

以高濃度逐漸稀釋的方式檢測不同濃度樣品對CL的影響，每個濃度樣品都做相應的空白對照。根據以上公式計算對羥自由基(·OH)的清除率，建立量效關系曲線，通過量效曲線求算出發光抑制率為50%時樣品的濃度(IC50)值，IC50值反映了樣品對羥自由基(·OH)的清除能力。IC50值越小，表明樣品清除羥自由基(·OH)的能力越強。

該體系的工作原理如下:

①Cu2 +被抗壞血酸還原為Cu+。

3　結果

根據表1的結果計算，六月雪水提取物對于羥自由基的IC50= 1．169 mg·mL－1。由抑制曲線圖(圖2)可以看到，在原濃度(3 000．000 mg·mL－1)時，羥自由基基本被完全清除，稀釋為原濃度的1/4、1/16、1/64時，羥自由基同樣被完全清除(清除率都在99%左右)，稀釋為原濃度的1/256(11．719 mg· mL－1)時，用超微弱發光儀可檢測到少量光子，在隨稀釋濃度的逐漸降低，其清除羥自由基的能力逐漸降低，當稀釋為原濃度的1/16 384 (0．183 mg· mL－1)時，六月雪水提取物對羥自由基的清除率仍保持在12．727%，說明六月雪水提取物對羥自由基有極強的清除能力。各曲線達峰時間隨濃度的逐漸稀釋而逐漸提前，說明六月雪水提取物在該體系中不僅可以清除羥自由基，而且可以延緩羥自由基的產生。在此反應體系中，原濃度的抑制率反而低于初始的幾個稀釋濃度，其具體原因有待進一步研究。

表1六月雪水提取物對羥自由基的抑制率

圖2　六月雪水提取物對羥自由基的抑制曲線

4　討論

過氧化氫(H2O2)是一種活性氧，很容易透過細胞膜進入細胞，并且通過過渡金屬離子參與的Fenton反應產生羥自由基(·OH)，引起機體的氧化損傷，即所謂氧化應激反應［6］。自由基具有高度的化學活性，是機體有效的防御系統，若不能維持一定水平則會影響機體的生命活動［7］。有研究表明，氧化應激和過氧化氫的劑量有關，低劑量的過氧化氫會使機體產生適應性?；A研究活性氧自由基在體內主要有三種形式: H2O2、·OH、O2－，羥自由基它是人體新陳代謝的副產物，可以與生物體內的許多物質如脂肪酸、蛋白質、核酸等作用，造成相關細胞結構和功能的破壞，在化學致癌過程中起著不可忽視的作用［8］。羥自由基·OH是體內最活潑的自由基，攻擊能力最強，對機體危害最大，可導致許多病理變化，如引發不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，并損傷膜結構及功能，因此羥自由基的檢測對于自由基的生物作用研究具有重要意義［9］。眾多研究已證明，氧化損傷與衰老、腫瘤、糖尿病、動脈硬化以及人類免疫缺陷病毒(HIV)感染等均有密切關系［10］。因此，如何清除自由基，防止氧化對生物體細胞和組織的破壞得到了普遍關注。尋找高效、低毒的抗氧化劑一直是近年來研究者們關注的課題。

六月雪在江西贛南18個縣均有分布、資源十分豐富，六月雪水提取物在贛南民間常用作酒精性胃出血，并且效果十分顯著，前期研究發現六月雪水提取物單獨用藥對乙醇誘導的胃黏膜損傷有明顯的修復作用，能明顯降低潰瘍面積指數，六月雪與黃花倒水蓮聯合用藥對無水乙醇、阿司匹林、鹽酸致大鼠胃黏膜損傷有明顯的保護作用，并且有一定的抗炎、促血小板生成、促凝血作用，作用機制可能和凝血因子以及調節激素水平有關［4，11］。羥自由基是應激性胃潰瘍的重要致病因子，最近研究發現六月雪水提取物作為羥自由基清除劑預先處理大鼠，均可顯著地減輕胃粘膜損傷，應激時，胃粘膜內的脂質過氧化分解產物丙二醛的含量顯著升高，組織化學的研究顯示，胃粘膜層含有豐富的黃嘌呤氧化酶，其活性在應激時明顯升高，預先用六月雪水提取物處理大鼠以抑制黃嘌呤氧化酶的活性，可使胃粘膜損傷顯著減輕。本實驗我們再次驗證六月雪水提取物在原濃度(3 000．000 mg·mL－1)時，羥自由基基本被完全清除，稀釋為原濃度的1/4、1/16、1/64時，羥自由基同樣被完全清除(清除率都在99%左右)，稀釋為原濃度的1/256(11．719 mg·mL－1)時，用超微弱發光儀可檢測到少量光子，在隨稀釋濃度的逐漸降低，其清除羥自由基的能力逐漸降低，當稀釋為原濃度的1/16 384(0．183 mg·mL－1)時，六月雪水提取物對羥自由基的清除率仍保持在12．727%，說明六月雪水提取物對羥自由基有極強的清除能力。說明六月雪水提取物在該體系中不僅可以清除羥自由基，而且可以延緩羥自由基的產生。六月雪水提取物中清除自由基活性成分的分離以及清除羥自由基的具體作用機制，是我們下一步準備研究的內容。

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Experimental Study of Serissa Serissoides Water Extraction in Vitro on Hydroxyl Radical Scavenging Activity

LI Hong-liang1，ZHOU Man1，DING Ye-chun1，FANG Xiao-na2
(1．School of Pharmacy; 2．Scientific Research Department，Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000)

Abstract:Objective: To study the function of water extraction in Serissa serissoides in vitro to scavenge the activities of hydroxyl free radical，and too prove thatthe protective effect of Serissa serissoides water extract on gastric mucosa injury is related to scavenging free radicals．Methods: Cu(2 +)was reduced to Cu+by ascorbic acid，which was in the excited state，and the luminescence of the excitation state．Antioxidants which can scavenge·OH，can decrease the excited state orth ophenanthroline and the emission intensity was employed to detect the scavenging ability of Serissa serissoides water extraction to hydroxyl radical in vitro．Results: With Serissa serissoides water extract of original concentration (3 000．00 mg· mL(－1))，hydroxyl radical was cleared of 98．978%．With the dilution of Serissa serissoides water extract solution，its ability to scavenge hydroxyl free radical decreased gradually．When the concentration of the dilution was the 1/16 384 of the origional concentration (0．183 mg·mL(－1))，the ability of Serissa serissoides water extract solution to scavenge hydroxyl free radical is close to that of the blank group．Conclusion: Serissa serissoides water extract has a good ability to savange the activity of hydroxyl free radical in vitro．As the dilution of the water extract solution in Serissa serissoides，its ability to scavange hydroxyl free radicals is gradually reduced．

Key words:Serissa serissoides water extracts; hydroxyl radical; benzene three phenol

(收稿日期:2015－10－15) (責任編輯:敖慧斌)

通訊作者:范小娜，女，教授，碩士生導師，主要從事中草藥活性成分篩選及新藥研發工作。E-mail: fxn918@126．com

*基金項目:江西省自然科學基金(編號: 20132BAB205078) ;江西省教育廳科技項目(編號: GJJ13680)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．007

中圖分類號:R285．5

文獻標志碼:A

文章編號:1001－5779(2016) 01－0027－04