人肺腺癌順鉑耐藥細胞A549/CDDP對鉑類化療藥的敏感性及耐藥基因表達改變的研究

李壯華，賈　筠，陳鏡塘，徐瑞華

(1．東莞市人民醫院腫瘤內科，廣東　東莞　523000; 2．華南腫瘤學國家重點實驗室，廣東　廣州　510060; 3．中山大學腫瘤防治中心內科，廣東　廣州　510060)

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人肺腺癌順鉑耐藥細胞A549/CDDP對鉑類化療藥的敏感性及耐藥基因表達改變的研究

李壯華1，賈筠1，陳鏡塘1，徐瑞華2，3

(1．東莞市人民醫院腫瘤內科，廣東東莞523000; 2．華南腫瘤學國家重點實驗室，廣東廣州510060; 3．中山大學腫瘤防治中心內科，廣東廣州510060)

摘要:目的:探討人肺腺癌細胞系A549/CDDP對鉑類化療藥耐藥的機制。方法:應用MTT法檢測人肺腺癌細胞A549及其順鉑耐藥細胞A549/CDDP對鉑類化療藥(CDDP、CBD及L-OHP)的敏感性，應用RT-PCR法比較兩細胞系多藥耐藥基因(包括MDR1，ABCG2，MRP1，LRP)，DNA-polβ和GST-pi等在mRNA水平的表達差異，篩選出差異基因，用Western blotting法驗證該基因在蛋白水平的表達差異。結果: MTT實驗發現，與人肺腺癌細胞系A549相比，順鉑耐藥細胞A549/CDDP對CDDP的耐藥系數(RI)為7．877，而A549/CDDP細胞也對CBD及LOHP交叉耐藥(RI分別為4．486及2．352) ; RT-PCR發現兩細胞系的MDR1，ABCG2，MRP1，LRP及GST-pi等耐藥基因在mRNA水平無明顯差異，但A549/CDDP細胞中DNA-polβ在mRNA及蛋白表達水平均較A549細胞明顯升高。結論: A549/CDDP細胞內DNA-polβ表達升高可能與鉑類耐藥有關。

關鍵詞:鉑類化療藥;多藥耐藥; DNA-polβ; GST-pi

順鉑(CDDP)、卡鉑(CBD)及奧沙利鉑(LOHP)等鉑類衍生物是現代腫瘤化學治療的重要藥物，其細胞毒作用是通過形成鉑-DNA絡合物，導致DNA損傷，誘導細胞凋亡而發揮作用［1］。但原發耐藥及獲得性耐藥限制了鉑類的進一步運用，是影響化療效果的最大障礙。順鉑(CDDP)、卡鉑(CBD)是臨床非小細胞肺癌的基礎用藥，若能了解肺癌鉑類耐藥機制從而逆轉癌細胞對CDDP、CBD的耐藥性，則有望提高非小細胞肺癌的化療療效。本研究的目的就是探索非小細胞肺癌鉑類耐藥的機制。

1　材料與方法

1．1材料RPMI-1640培養液(美國Gibco公司) ; Trizol (美國Invitrogen公司) ;小牛血清(杭州四季青公司) ;四噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司) ; CDDP和CBD(美國Bristol-Myers Squibb公司)，L-OHP(法國Sanofi-aventis公司) ; MDR，MRP1，ABCG2，LRP，GST-pi，DNA-polβ和GAPDH的引物(美國Invitrogen公司合成) ;二步法RT-PCR試劑盒: Taq酶、oligo-dT、dNTP、DEPC、MMLV、Rnasin等(美國Promega公司) ;抗體:一抗為小鼠抗人DNA-polβ(英國abcam公司)和GAPDH(武漢Boster公司) ;二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(上海KangChen公司)。

1．2方法

1．2．1細胞系和細胞培養人肺腺癌細胞系A549及其順鉑耐藥細胞系A549/CDDP［2］用含10%新生小牛血清的RPMI-1640培養基，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，0．25%胰蛋白酶消化傳代。

1．2．2 MTT法以5×103·孔－1接種A549及549/CDDP細胞于96孔培養板，設3個復孔，過夜貼板后實驗組加入濃度梯度的鉑類化療藥，另設細胞對照組(只加細胞不加藥)和空白對照組(只加培養基)，共同孵育72 h，每孔加入MTT(5 mg· mL－1) 20 μL，繼續培養4 h后棄上清液，每孔加入DMSO 200 μL，室溫振蕩15 min，用酶標儀(波長570 nm和630 nm)測定光吸收值(OD值)，抑制率= (1－實驗組OD值均值/細胞對照組OD值均值) ×100%，計算半數抑制濃度(IC50)值。實驗重復3次。耐藥指數(resistance index，RI) =耐藥細胞IC50/敏感細胞IC50。

1．2．3 RT-PCR檢測多藥耐藥基因的表達消化收集A549及549/CDDP細胞，參照Trizol試劑盒說明書提取細胞中總RNA，利用逆轉錄酶M-MLV試劑盒合成cDNA。使用Promega的PCR試劑盒進行擴增，反應體系為: cDNA模版2 μL，2×GoTaq?Green Master Mix 12．5 μL，上下游引物各2．5 μL，DEPC-treated water擴容至25 μL。擴增條件: 94℃預變性5 min后，94℃30 s、退火30 s、72℃30 s，反應30個循環，最后一輪72℃延伸5 min，4℃保存。引物及退火溫度見表1。擴增產物取5 μL在1．5%瓊脂糖上電泳，紫外燈下觀察結果并照相，吸光度掃描儀掃描PCR條帶，GAPDH mRNA為內對照。以上結果重復3次。

表1　RT-PCR合成的引物Table 1 Primers used for RT-PCR analysis

1．2．4 Western blotting法檢測按常規方法裂解細胞，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，電轉移至PVDF膜，然后用含5%脫脂奶Tris緩沖液封閉膜上的非蛋白結合點，4℃過夜，加1∶200稀釋的特異性鼠抗人DNA polβ單克隆抗體和1∶5 000稀釋的鼠抗人GAPDH抗體，室溫作用4 h。漂洗3次后加第二抗體(辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG抗體)室溫作用2 h，漂洗3次后用ECL化學發光試劑盒處理并暗室顯影。實驗重復3次。

1．3統計學方法用SPSS 10．0軟件進行t檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

2．1對鉑類化療藥的敏感性MTT實驗結果顯示，A549和A549/CDDP細胞對三個鉑類化療藥(CDDP，CBD和L-OHP)的敏感性明顯不同，見表2。在A549和A549/CDDP細胞，CDDP的IC50分別為3．787 μM、29．83 μM，CBD的IC50分別為45．85 μM、205．7 μM，L-OHP的IC50分別為7．683 μM、18．07 μM。與親代細胞A549相比，順鉑耐藥細胞A549/CDDP 對CDDP的耐藥系數(RI)為7．877，對CBD和L-OHP的耐藥系數(RIs)分別為4．486、2．352，提示A549/CDDP耐順鉑細胞不僅對順鉑耐藥，對CBD、L-OHP也表現出交叉耐藥性。

表2　A549和A549/CDDP細胞對鉑類化療藥(順鉑，卡鉑和奧沙利鉑)的藥物敏感性Table 2 Drugs＇sensitivities of A549，A549/CDDP cells to platinum derivatives (CDDP，CBDCA and L-OHP)

2．2 RT-PCR分析耐藥基因在A549和A549/CDDP細胞mRNA水平的表達RT-PCR檢測A549和A549/CDDP細胞兩組細胞中多藥耐藥基因(包括MDR1，ABCG2，MRP1，LRP)，DNA-polβ，GST-pi等在mRNA水平的表達，結果如圖1，在內參GAPDH mRNA均等條件下，A549和A549/CDDP細胞中MDR1、ABCG2、MRP1和LRP等多藥耐藥基因及GST-pi的mRNA表達水平無明顯差異，但是A549/ CDDP中的DNA polβ mRNA水平較A549明顯升高。

2．3 Western blotting檢測DNA-polβ在A549和A549/CDDP細胞蛋白水平的表達Western blotting法進一步檢測DNA-polβ蛋白在A549和A549/CDDP中的表達，結果見圖2，在內參GAPDH蛋白均等條件下，與A549細胞相比，A549/CDDP細胞中的DNA polβ蛋白表達水平明顯升高，與DNA polβ mRNA變化一致。

圖1　RT-PCR比較A549和A549/CDDP細胞中耐藥相關基因(MDR1，ABCG2，ABCC1，LRP，DNApolβ，GSTpi)的表達Figure 1 Expressions of drug resistance-related genesMDR1，(ABCG2，ABCC1，LRP，DNApolβ，GSTpi) in A549 and A549/CDDP cells determined by RT-PCR

圖2　Western印跡法比較A549和A549/CDDP細胞中DNApolβ的表達Figure 2 DNApolβ protein expressions in A549，A549/CDDP cells determined by Western-blot

3　討論

鉑類化療藥物(包括CDDP、CBD)是目前治療非小細胞肺癌的基礎化療藥之一。鉑類耐藥是含鉑化療方案失敗的主要因素之一，限制了CDDP、CBD在肺癌的使用。

我們研究發現，與親代細胞系A549相比，人肺腺癌順鉑耐藥細胞系A549/CDDP不僅對CDDP耐藥(RI達到7．87)，同時對CBD、L-OHP也表現出交叉耐藥現象(RIs分別為4．486和2．352)，提示A549/CDDP是多藥耐藥細胞。根據IC50的結果判斷，兩株細胞對鉑類化療藥的敏感性為: CDDP＞L-OHP＞CBD。從RI大小來看，第三代鉑類化療藥L-OHP RI值最低，這可能與其結構中含有獨特的1，2-二氨基環已烷，明顯不同于CDDP和CBD的結構相關［3］。Raymond［4］也報導L-OHP對CDDP耐藥細胞株有效。腫瘤細胞對鉑類耐藥的機制包括:藥物蓄積降低、解毒能力升高增強和DNA修復增強等［5］。多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是許多腫瘤細胞耐藥的重要機制，ABC轉運蛋白(ATP binding cassette transporters，ABC)是其重要的執行分子［6］，主要包括: ABCB1 (MDR1)，編碼P—gP; ABCC1(MRP1)，編碼MRP; ABCG2 (BCRP/MXR/ ABCP)，編碼BCRP。但是很少報導ABC轉運蛋白參與鉑類耐藥。我們研究發現，A549和A549/CDDP細胞中MDR1、ABCG2、MRP1及LRP等多藥耐藥基因mRNA表達無明顯差異，因此推測A549/CDDP細胞對鉑類化療藥的耐藥性可能與ABC轉運蛋白關系不大，這與順鉑耐藥食管癌細胞研究一致［7］。胞漿中谷胱甘肽(GSH)，由谷胱甘肽S-轉移酶(GST)催化合成，可與重金屬耦合從而提高細胞對鉑類的解毒能力，引起鉑類耐藥。J Wang［8］報導GST-pi參與順鉑耐藥，但在我們實驗中，GST-pi在A549和A549/CDDP細胞中無明顯變化，提示GST-pi可能不參與A549/CDDP的鉑類耐藥。

DNA作為鉑類化療藥攻擊的靶分子，因此DNA損傷修復能力異常與腫瘤耐藥性的形成有密切關系。DNA修復機制復雜，主要是存在5種途徑［9］:核苷酸切除修復(nucleofide excision repair，NER)，錯配修復(mismatch repair，MMR)，堿基切除修復(base excision repair，BER)，同源重組修復、非同源末端連接，以及新近日益受到重視的線粒體DNA修復。DNA修復能力增強是肺癌鉑類耐藥的重要機制［10－13］。DNA聚合酶(DNA polymerase)是BER的重要組成部分，其中DNA聚合酶β(DNA polymerase beta，DNA polβ)是看家基因，從酵母到哺乳類細胞均高度保守，在正常情況下低表達，且與細胞周期無關。DNA polβ表達過低、突變或缺失，均可造成DNA修復功能缺陷，如不及時修復則導致突變或細胞毒性［14－15］，DNA polβ能夠修復鉑類誘導的DNA損傷，并且DNA polβ的表達絕對或相對升高將干擾或取代細胞內其他聚合酶的正常功能。本實驗發現，A549/CDDP細胞內DNA polβ在mRNA及蛋白表達水平均明顯高于A549細胞，提示DNA polβ表達增高可能是A549/CDDP對鉑類產生耐藥的機制之一。當然，腫瘤細胞耐藥機制非常復雜，是多種機制共同作用的結果，尚有很多機制未被闡明，有待進一步研究。

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Sensitivities to Platinum Drugs and the Expressions of Drug Resistance Genes in the Human Lung Adenocarcinoma CDDP-resistant Cell Sublines A549/CDDP

LI Zhuang-hua1，JIA Jun1，CHEN Jing-tang1，XU Rui-hua2，3
(1．Dept．of Medical Oncology，Dongguan People＇s Hospital，Dongguan，Guangdong 523000; 2．State Key Laboratory of Oncology in South China，Guangzhou，Guangdong 510060; 3．Dept．of Medicine，Sun Yat-sen University Cancer Center，Guangzhou，Guangdong 510060)

Abstract:Objective: To explore the mechanism for platinum-resistance in the human lung adenocarcinoma CDDP-resistant cell sublines A549/CDDP．Methods: In CDDP-sensitive cell lines A549 and the corresponding CDDP-resistant cell subline A549/CDDP，platinum drugs＇sensitivities were determined by MTT assay，then multidrug resistance(MDR) -related genes (such as MDR1，ABCG2，MRP1，LRP)，DNA-polβand GST-pi were analyzed by RT-PCR，and then the changes at mRNA level were confirmed by Western-blotting at protein-levels．Results: CDDP-resistant cell sublines A549/ CDDP which was 7．877 folds more resistant than the parental cell line A549 showed cross resistance to CBD and L-OHP (4．486 and 2．352 folds respectively)．Between A549 and A549/CDDP cells，there were no significant differences in expressions of MDR1，ABCG2，MRP1，LRP and GST-pi; however，DNA-polβexpression in A549/CDDP was significantly higher than A549 cell at both mRNA and protein levels．Conclusion: The results indicates that DNA-polβmay be related to the platinum-derivates resistance in A549/CDDP．

Key words:platinum-derivates; MDR; DNA-polβ; GST-pi

(收稿日期:2015－08－18) (責任編輯:敖慧斌)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．010

中圖分類號:R734．2

文獻標志碼:A

文章編號:1001－5779(2016) 01－0038－04