苜蓿黃酮對熱應激下體外培養奶牛乳腺上皮細胞凋亡的影響

占今舜，魏明吉,2，蘇效雙，詹康，劉明美,3，張春剛,4，趙國琦*

(1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2.臨沂大學生命科學學院，山東 臨沂 276000；3.江蘇聯合職業技術學院

淮安生物工程分院，江蘇 淮安 223200；4.上海光明荷斯坦牧業有限公司，上海 200443)

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苜蓿黃酮對熱應激下體外培養奶牛乳腺上皮細胞凋亡的影響

占今舜1，魏明吉1,2，蘇效雙1，詹康1，劉明美1,3，張春剛1,4，趙國琦1*

(1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2.臨沂大學生命科學學院，山東 臨沂 276000；3.江蘇聯合職業技術學院

淮安生物工程分院，江蘇 淮安 223200；4.上海光明荷斯坦牧業有限公司，上海 200443)

摘要：本實驗旨在研究苜蓿黃酮對熱應激下體外培養奶牛乳腺上皮細胞的影響。將乳腺上皮細胞分成5組，每組培養基中分別含有0,25,50,75和100 μg/mL苜蓿黃酮，同時置于細胞培養箱37℃，5%CO2培養72 h，再在 42℃恒溫水浴鍋中熱應激1 h后返回細胞培養箱培養12 h，檢測細胞活性、抗氧化指標和相關基因的表達。結果顯示：1)添加25 μg/mL組的細胞活性顯著高于0和50 μg/mL組(P<0.05)，其他各組之間差異不顯著。2)相對于0 μg/mL組，50～100 μg/mL組細胞的GSH-Px活性升高(P<0.01)，LDH和MDA含量降低(P<0.01或P<0.05)，而CAT活性無顯著性差異。3)相對于0 μg/mL組，50和75 μg/mL組Caspase3和Socs3基因表達降低(P<0.01)，25 μg/mL組P53、Stat1和Socs1基因表達升高(P<0.01或P<0.05)，而Bcl-2和Fas基因表達無顯著差異。綜上所述，在熱應激下，苜蓿黃酮能夠提高體外培養奶牛乳腺上皮細胞的活性，改善抗氧化能力和抑制細胞凋亡，其中添加75 μg/mL效果較好。

關鍵詞：黃酮；奶牛；乳腺上皮細胞；熱應激

紫花苜蓿(Medicagosativa)由于營養價值高，含有豐富的蛋白質、粗纖維、維生素以及微量元素，被稱為“牧草之王”，是我國最重要的栽培牧草之一[1-2]。苜蓿中的黃酮類化合物是一類含有2-苯基色原酮結構的化合物，包括黃酮醇、花色素、異黃酮等物質[3]。苜蓿中黃酮含量較高，據報道，45個紫花苜蓿品種中有70%以上品種的總黃酮含量為0.6%～0.9%[4]。黃酮類化合物具有抗氧化、改善血液循環、抑制炎癥等作用，添加在飼料中可促進動物生長和改善繁殖性能等。歐陽克蕙等[5]研究發現，飼糧中添加苜蓿黃酮不會影響生長后期的崇仁麻雞母雛生產性能，但降低平均日采食量，減少脂肪沉積。朱宇旌等[6]研究發現，苜蓿黃酮對小鼠生長性能的影響與性別和劑量有關，低劑量處理可顯著地提高雄性小鼠的生長性能，高劑量能改善小鼠的特異性和非特異性免疫功能。王偉等[7]發現，苜蓿總黃酮能夠顯著降低下丘腦中GnRH和垂體FSH的表達量，高劑量組FSH的表達量顯著降低和LHR表達量顯著升高，說明苜蓿總黃酮通過影響下丘腦-垂體-卵巢性腺軸來改善妊娠期間雌鼠的繁殖性能。細胞培養技術是在活體內取出與試驗相關組織或細胞，在體外模擬體內生理環境，且建立無菌、適溫和一定的營養條件，使細胞生長和生存并維持其結構與功能的一種方法。該方法具有易于提供性狀相似的試驗對象，耗資少，對于大型經濟動物來講比較經濟等特點，被廣泛用于醫藥、農業等領域[8-9]。目前，利用細胞培養技術來研究苜蓿黃酮對熱應激下奶牛乳腺上皮細胞的影響鮮見報道。因此，本試驗研究熱應激下，苜蓿黃酮對奶牛乳腺上皮細胞的影響，目的是從細胞水平研究苜蓿黃酮對奶牛的影響，豐富相關理論的研究，為推廣苜蓿黃酮在奶牛生產上的應用提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

苜蓿黃酮購于陜西綠清生物工程有限公司，奶牛乳腺上皮細胞由本試驗室通過組織塊培養法獲得。

1.2試驗方法

1.2.1細胞培養試驗于2014年10月開始進行，將細胞置于DMEM/F12 (Gibco，美國)培養基在37℃， 5% CO2的培養箱中培養，培養基中含有10%的胎牛血清(Gibco，美國)、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素(Sigma，美國)。

1.2.2噻唑藍(MTT)法檢測細胞活性以密度為3×104個/mL細胞接種到96孔板，分為5組，即基礎培養基中分別加0,25,50,75和100 μg/mL苜蓿黃酮，每組5個重復，其中苜蓿黃酮用DMSO(索萊寶，北京)完全溶解，各處理組中的二甲基亞砜(DMSO)含量為2‰。細胞于37℃，5% CO2培養箱中培養72 h后，將其置于42℃恒溫水浴鍋中熱應激1 h后回細胞培養箱培養12 h，然后分別在每孔中加入20 μL 0.5% MTT，放回培養箱中繼續培養4 h，然后去除培養液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2遍，每孔加入DMSO 150 μL于搖床混勻10 min，最后在490 nm下測定OD值。

1.2.3抗氧化指標的測定取密度為2.5×105個/mL細胞接種到12孔板，方法同上。然后根據購買于南京建成生物工程研究所試劑盒中的說明書測定一氧化氮(nitric oxide，NO)含量、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.2.4細胞總RNA的提取和cDNA的合成取密度為5×105個/mL細胞接種到6孔板，方法同上。然后根據購買于天根生化科技有限公司RNA提取試劑盒中的說明書進行組織總RNA的提取，采用One Drop儀器進行總RNA的濃度和純度的測定。采用Takara反轉錄試劑盒進行cDNA的合成，cDNA合成試驗在冰上進行，10 μL體系，反應條件為37℃ 15 min、85℃ 5 s、4℃保存。所得cDNA保存于-20℃待測。

1.2.5引物設計根據GeneBank中的基因序列，采用Primer 5.0軟件設計引物，引物由Invitrogen公司合成(表1)。

表1　引物設計

1.2.6Real Time-PCR條件根據TaKaRa試劑盒說明書進行冰上配制反應液(表2)，后在羅氏Light Cycler?96 PCR儀上進行檢測。

1.3數據處理

采用2-ΔΔCt方法進行基因相對表達量計算，用Excel 2007進行試驗數據預處理，結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 17.0單因素方差分析(ANOVA)，LSD法多重比較，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2結果與分析

2.1苜蓿黃酮對乳腺上皮細胞活性的影響

由表3可知，添加25 μg/mL苜蓿黃酮組的奶牛乳腺上皮細胞活性顯著高于0 和50 μg/mL組(P<0.05)，其他各組之間差異不顯著。說明添加低劑量的苜蓿黃酮具有提高乳腺上皮細胞抗熱應激的作用。

表2　RT-PCR反應液

PCR反應條件為：95℃預變性30 s；PCR反應為95℃、5 s，60℃、20 s，循環40次；融解曲線分析65℃、15 s。Reaction conditions of PCR: initial denaturation in 95℃,30 s;PCR reaction in 95℃ 5 s,60℃ 20 s,40 cycles; melting curve analysis in 65℃,15 s.

表3　苜蓿黃酮對乳腺上皮細胞活性的影響

注:同行不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著 (P<0.01)，下同。

Note: In the same row, values with different lowercases mean significant differences (P<0.05) and different capital letters mean highly significant differences (P<0.01). The same below.

2.2苜蓿黃酮對乳腺上皮細胞抗氧化性指標的影響

由表4可知，相對于0 μg/mL組，25～100 μg/mL組細胞的GSH-Px活性均顯著提高(P<0.01)，但LDH活性則相反；100 μg/mL組細胞的NO含量降低(P<0.05)，50～100 μg/mL組細胞MDA含量降低(P<0.01或P<0.05)，50 μg/mL組細胞的SOD活性降低(P<0.01)，但各處理組的CAT活性無顯著性差異。說明添加苜蓿黃酮具有改善細胞的抗氧化功能。

表4　苜蓿黃酮對乳腺上皮細胞抗氧化指標的影響

2.3苜蓿黃酮對乳腺上皮細胞相關基因表達的影響

由表5可知，各處理組Bcl-2和Fas基因表達無顯著差異，50和75 μg/mL組Caspase3和Socs3基因表達顯著低于0 μg/mL組(P<0.01)。相對于0 μg/mL組，25 μg/mL組P53、Stat1和Socs1基因表達升高(P<0.01或P<0.05)。說明添加適量的苜蓿黃酮能夠抑制細胞的凋亡。

表5　苜蓿黃酮對乳腺上皮細胞相關基因表達的影響

3討論

周振峰等[10]研究發現，奶牛乳腺上皮細胞在42℃高溫處理下生長停滯，細胞凋亡率在 42℃高溫培養測定的第3 h達到最大值。宋學立等[11]發現，熱應激促使細胞活性氧(ROS)升高是導致心肌細胞損傷的重要機制之一，細胞凋亡是熱應激心肌細胞死亡的主要途徑。說明熱應激能夠導致細胞活力下降，誘導細胞凋亡。劉春龍等[12]和林成招等[13]研究發現，適量的大豆異黃酮能夠促進奶牛乳腺上皮細胞和大鼠小腸細胞的增殖。陳靜[14]研究發現，在一定范圍內，槲皮素能夠上調奶牛乳腺上皮細胞存活率。說明黃酮類化合物具有提高細胞活性的功能。在本試驗中，添加苜蓿黃酮具有改善奶牛乳腺上皮細胞活性的趨勢。原因可能是熱應激導致細胞產生ROS，而黃酮通過釋放的H+與活性氧ROS相結合，直接清除氧自由基[15-16]，從而降低氧自由基對細胞的損傷，提高細胞活性。

一般情況下，細胞內自由基的產生和清除處于平衡狀態，不會對細胞造成傷害。然而，當細胞內大量自由基積累，會產生大量MDA，促使細胞解體，最終導致細胞死亡[9]。牟瑛等[17]研究二羥異黃酮和三羥異黃酮處理過氧化氫誘導的中國倉鼠卵巢細胞，發現細胞的LDH釋放量和MDA的含量降低。劉英華等[18]發現，大豆異黃酮能夠升高氧化損傷的血管內皮細胞的SOD和GSH-Px的活性及NO的濃度。余薇等[19]發現，葛花總黃酮預處理能夠提高缺氧/復氧心肌細胞的SOD活性，降低培養液中iNOS釋放量及胞內MDA含量。陳靜[14]研究表明，槲皮素能上調細胞SOD活性，下調MDA含量及胞外LDH活性。在本試驗中，苜蓿黃酮提高奶牛乳腺上皮細胞的GSH-Px的活性，降低LDH活性和MDA的含量。說明苜蓿黃酮能夠通過提高抗氧化酶的活性來減緩氧化應激，進而保護細胞免受損傷，抑制細胞死亡。

在熱應激下，細胞的ROS活性升高，其在細胞內的積累會導致Bax表達、Caspase活化等現象[20]。Caspases家族成員大多數是凋亡的啟動子或效應子，在細胞凋亡過程中發揮重要作用。其中 Caspase-3 被認為是凋亡的關鍵蛋白酶，一旦被激活，凋亡就不可避免[21]。在本試驗中，添加25～75 μg/mL苜蓿黃酮組的Caspase-3 基因表達均顯著低于未添加組，說明在熱應激下，苜蓿黃酮可能通過清除細胞內的ROS來抑制Caspase蛋白的活化，進而抑制細胞的凋亡。Bcl-2可能是通過影響內質網內 Ca2+的釋放、抑制氧自由基的產生以及和Bax等結合形成異構二聚體來抑制細胞凋亡[22]。張錦等[23]研究發現，黃酮類化合物通過上調Bcl-2蛋白的表達和抑制Bax蛋白的表達來抑制小鼠心肌細胞的凋亡。在本試驗中，苜蓿黃酮對乳腺上皮細胞的Bcl-2基因表達沒有顯著影響。與其不同可能是物種不同以及黃酮的種類不同造成的。P53能夠激活細胞凋亡受體Fas，而Fas與FasL 相結合產生三聚體Fas復合體，就能誘導細胞凋亡[24-25]。在本試驗中，75 μg/mL組細胞的P53基因表達降低，說明苜蓿黃酮可能通過抑制P53的表達來抑制細胞凋亡。然而在本試驗中Fas基因表達未降低，可能是因為DNA損傷而誘導的Fas表達具有組織特異性，并不需要P53參與[26]。在本試驗中，Fas基因表達無顯著性變化，說明苜蓿黃酮可能不通過調節Fas的表達來抑制細胞凋亡。信號傳遞與轉錄激活因子1(Stat1)通過激活P53、Caspases和TNF-α凋亡蛋白，抑制抗凋亡Bcl-2和Bcl-x基因的表達來促進細胞凋亡[27]。從本試驗結果來看，苜蓿黃酮對細胞Stat1基因表達影響不大。熱應激能夠促進細胞因子IL-6的分泌，IL-6刺激細胞產生活化的Stat3，進而誘導Socs1的生成。Socs1能夠干擾細胞中IL-6信號轉導子gp130和Stat3的酪氨酸激酶磷酸化，從而抑制凋亡[28]。Socs3的過表達，會抑制Stat3信號路與NF-κB信號在細胞核內存在信號交聯，促進細胞凋亡[29]。從本試驗結果來看，在熱應激下，苜蓿黃酮可能通過促進Socs1的表達和抑制Socs3的表達來調節Stat3的表達，進而抑制細胞凋亡。

4結論

在熱應激下，添加低劑量的苜蓿黃酮能夠提高體外培養奶牛乳腺上皮細胞的活性；苜蓿黃酮能夠提高細胞的GSH-Px的活性，降低LDH活性和MDA的含量，從而改善細胞的抗氧化能力；苜蓿黃酮可能通過抑制Caspases3的表達以及通過促進Socs1的表達和抑制Socs3的表達來調節Stat3的表達，進而抑制細胞凋亡。從本試驗結果來看，添加75 μg/mL 組的效果較好。

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Effect of alfalfa flavonoids on bovine mammary epithelial cell culturesinvitrounder heat stress

ZHAN Jin-Shun1, WEI Ming-Ji1,2, SU Xiao-Shuang1, ZHAN Kang1, LIU Ming-Mei1,3, ZHANG Chun-Gang1,4, ZHAO Guo-Qi1*

1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China； 2.CollegeofAnimalScience,LinyiUniversity,Linyi276000,China； 3.JiangsuJointInstituteofTechnologyofProfessionofHuai’anBio-engineeringBranch,Huai’an223200,China; 4.ShanghaiBrightHolstanCo.,Ltd,Shanghai200443,China

Abstract:The aim of this study was to evaluate the effect of alfalfa flavonoids on in vitro bovine mammary epithelial cells under heat stress. Bovine mammary epithelial cells were cultured on media with different concentrations of alfalfa flavonoids (0, 25, 50, 75, and 100 μg/mL) at 37℃ with 5% CO2 for 72 h. Then, the cultured cells were subjected to a heat-shock treatment (42℃ for 1 h) before being returned to 37℃ with 5% CO2 for 12 h. The cell activity, antioxidant index, and gene transcript levels were evaluated. The results showed that the cell activity was significantly higher in the 25 μg/mL treatment group than in the 0 and 50 μg/mL treatment groups (P<0.05), but cell activity did not differ significantly among the other groups. Compared with the control group (0 μg/mL) the 50, 75, and 100 μg/mL treatment groups showed significantly higher glutathione peroxidase activity (P<0.01) and significantly lower lactate dehydrogenase activity and malondialdehyde contents (P<0.01 and P<0.05, respectively). The catalase activity did not differ significantly among the five groups. Compared with the control group (0 μg/mL), the 50 and 75 μg/mL treatment groups showed reduced transcript levels of Caspase3 and Socs3, and the 25 μg/mL group showed significantly increased transcript levels of P53, Stat1, and Socs1 (P<0.01 or P<0.05). The transcript levels of Bcl-2 and Fas did not differ significantly among the groups. Together, these results show that alfalfa flavonoids can increase cell activity and antioxidant capacity and inhibit cell apoptosis, and that the optimal concentration of alfalfa flavonoids is 75 μg/mL.

Key words:flavonoids; dairy cow; mammary epithelial cell; heat stress

*通信作者

Corresponding author. E-mail:gqzhao@yzu.edu.cn

作者簡介：占今舜(1985-)，男，江西玉山人，在讀博士。E-mail:zhanjinshun1985@163.com

基金項目：江蘇省高校優勢學科建設工程項目(PAPD)，長三角地區生鮮乳質量安全追溯體系關鍵技術研究應用項目(14395810100)和江蘇省高校研究生科研創新計劃項目(KYZZ_0367)資助。

*收稿日期：2015-06-25；改回日期：2015-09-30

DOI：10.11686/cyxb2015317

http://cyxb.lzu.edu.cn

占今舜, 魏明吉, 蘇效雙, 詹康, 劉明美, 張春剛, 趙國琦. 苜蓿黃酮對熱應激下體外培養奶牛乳腺上皮細胞凋亡的影響.草業學報, 2016, 25(4): 159-165.

ZHAN Jin-Shun, WEI Ming-Ji, SU Xiao-Shuang, ZHAN Kang, LIU Ming-Mei, ZHANG Chun-Gang, ZHAO Guo-Qi. Effect of alfalfa flavonoids on bovine mammary epithelial cell culturesinvitrounder heat stress.Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(4): 159-165.