優良抑菌活性乳酸菌對玉米青貯及有氧暴露期微生物數量和pH的影響

萬學瑞，吳建平，雷趙民*，何軼群，吳潤

(1.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070)

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優良抑菌活性乳酸菌對玉米青貯及有氧暴露期微生物數量和pH的影響

萬學瑞1，吳建平2，雷趙民2*，何軼群1，吳潤1

(1.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070)

摘要：為了探討乳酸菌對全株玉米青貯及有氧暴露后青貯飼料中乳酸菌、好氧細菌、酵母菌和霉菌數量及其pH的影響，進一步篩選出可提高青貯飼料品質和有氧穩定性的乳酸菌接種劑，將實驗室前期從甘肅各地玉米秸稈青貯飼料中分離篩選獲得的5株產酸快、多且具有抑菌活性的優良乳酸菌分別添加全株玉米進行青貯，分析青貯過程和有氧暴露后青貯飼料中乳酸菌、好氧細菌、酵母菌和霉菌數量的動態變化及pH。結果顯示，在青貯過程和有氧暴露后，分別添加腸膜明串珠菌腸膜亞種B1-7、戊糖片球菌B2-3、植物乳桿菌B3-1、屎腸球菌B5-2和發酵乳桿菌E2-3的各處理組乳酸菌總數均顯著高于對照組，而好氧細菌、酵母菌和霉菌數量均顯著低于對照組，pH亦低于對照組。其中B1-7和B5-2處理組在青貯初期乳酸菌總數最多，從青貯第7天開始到有氧暴露的30 d內，始終是B3-1處理組乳酸菌總數最多，好氧細菌、酵母菌和霉菌數量最少、pH最低。以上結果表明這5株乳酸菌具有提高青貯飼料品質和有氧穩定性的潛力，其中植物乳桿菌B3-1的效果最好。

關鍵詞：全株玉米；青貯；植物乳桿菌B3-1；pH

青貯過程是一個復雜的微生物發酵體系，有乳酸菌、腐敗細菌、酵母菌、霉菌、芽孢桿菌等多種微生物參與，其中乳酸菌被認為是決定青貯發酵能否成功的關鍵微生物。青貯飼料品質的好壞與它所含乳酸菌的類型、數量和活性有很大的關系，但秸稈類植物表面附生的乳酸菌數量往往較少，為調制高品質的青貯飼料，最可行有效的方法是添加優質乳酸菌，增加青貯飼料原料中初始乳酸菌數量，使之盡快盡早進入乳酸發酵階段，乳酸濃度增加，pH迅速下降，抑制有害菌的生長，改善青貯飼料發酵品質，青貯料才能長期保存完好[1-2]。如全株玉米(Zeamays)中添加乳酸菌制劑使青貯飼料發酵過程中的有益微生物數量急劇增加，抑制了酪酸菌及其他不良菌的繁殖，明顯改善了青貯飼料的發酵品質[3]。在意大利黑麥草(Loliumperenne)中添加乳酸菌能有效地抑制霉菌、酵母菌和細菌的繁殖，提高乳酸的含量，降低青貯飼料的pH值，改善青貯飼料的發酵品質[4]。異型發酵乳酸菌雖然累積乳酸的能力不如同型發酵乳酸菌，但其除了能產生乳酸，還能產生揮發性短鏈脂肪酸如乙酸等，能有效抑制需氧性微生物如酵母菌和霉菌的生長，可抑制青貯飼料的二次發酵，提高有氧穩定性，減少青貯飼料在飼喂過程中的營養損耗[5-8]。目前，已報道能提高青貯飼料有氧穩定性的乳酸菌主要是布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)，如全株玉米中添加布氏乳桿菌進行青貯，可降低青貯飼料的乳酸濃度，提高乙酸濃度，降低酵母菌數量，提高青貯飼料的有氧穩定性[9]。因此，篩選更多的能抑制青貯飼料二次發酵，提高有氧穩定性的青貯用乳酸菌勢在必行。

作為青貯添加劑的優良乳酸菌必須具有較強的附著能力和生長能力[10]，而從青貯原料或青貯飼料中分離篩選乳酸菌最容易滿足以上要求。雖然關于玉米青貯的乳酸菌已有較多報道[11-12]，但還沒有適合甘肅地區全株玉米青貯的乳酸菌接種劑，本實驗室前期從甘肅各地玉米秸稈青貯飼料中分離獲得32株乳酸菌，利用產酸試驗和抑菌試驗篩選青貯用優良乳酸菌，其中植物乳桿菌B3-1培養6 h時pH即達到3.3，8 h達到3.0，產酸較快、較多，且其培養上清液對供試的金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門菌、大腸桿菌和酵母菌均具有較強的抑菌活性，但對青霉、曲霉和根霉菌沒抑菌活性。腸膜明串珠菌腸膜亞種B1-7、戊糖片球菌B2-3、屎腸球菌B5-2、發酵乳桿菌E2-3分別在分離的同類型乳酸菌中產酸和抑菌特性均最優[13]。以上5株乳酸菌均顯示出優良的青貯潛能，為驗證其青貯效果，本研究以這5株乳酸菌作為接種劑，實驗室內青貯全株玉米。通常，評價乳酸菌接種劑對青貯飼料品質及有氧穩定性的影響效果是通過檢測發酵產物，然而，青貯飼料中微生物菌群的變化是導致發酵產物改變的主要原因，因此，本論文通過跟蹤分析青貯過程和有氧暴露后青貯飼料中微生物數量的動態變化及pH，初步判斷接種乳酸菌的青貯潛能，為篩選出更加適合甘肅地區全株玉米青貯發酵的優良乳酸菌提供依據。

1材料與方法

1.1菌種

供試乳酸菌包括：腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostocmesenteroidessubsp.Mesenteroides)B1-7、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceu)B2-3、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)B3-1、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)B5-2、發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)E2-3均由本實驗室分離鑒定并保存。

1.2青貯飼料的調制

2012年9月16日，自甘肅農業大學動物科學技術學院產學研基地(甘肅省臨洮縣)采集青貯用全株玉米，經切割機切成2～4 cm，混勻即為青貯原料，用微波爐進行快速干燥，以掌握含水量，當萎蔫至含水量達到70%左右(過夜)進行青貯。各供試乳酸菌用Modified Sholtens’ Broth(MSB液體培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，K2HPO42 g，檸檬酸氫二銨2 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，吐溫-80 1.0 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1000 mL，調pH值至6.2～6.4，121℃滅菌30 min)培養至對數生長期，調濃度為1×109cfu/mL，按5 mL/kg青貯原料添加，即5×106cfu/g。試驗設9個處理：腸膜明串珠菌腸膜亞種B1-7組(B1-7)；戊糖片球菌B2-3組(B2-3)；植物乳桿菌B3-1組(B3-1)；屎腸球菌B5-2組(B5-2)；發酵乳桿菌E2-3組(E2-3)；不添加乳酸菌的MSB液體培養基為對照組(CK)。

將菌液用滅菌噴壺均勻噴灑于切碎的玉米秸稈上混勻。按500 g/袋裝入22 cm×28 cm聚乙烯包裝袋中，按緊、壓實，利用DZ-300A多功能真空封口機(溫州卓越機電有限公司)抽氣封口，每個處理30個重復。于恒溫環境(20℃)中進行發酵，分別在青貯第3，7，15，30天取樣，每處理每次隨機取3袋；于青貯第30天時將剩余青貯袋打開暴露于氧氣中，分別在開袋后第1，3，7，15，30天取樣，每處理每次隨機取3袋，進行微生物計數及青貯飼料pH值測定。

1.3微生物計數及結果統計

采用四分法準確稱取25 g樣品，加入225 mL的無菌生理鹽水，37℃恒溫搖床搖動2 h后做10倍梯度稀釋，選擇3個合適連續的稀釋度，每稀釋度取0.1 mL涂平板，2個重復。乳酸菌的計數用MSB培養基平板[14]，將接種好的培養皿用封口膜密封好后置于37℃培養3 d后統計菌落數；細菌計數采用普通瓊脂培養基平板，接種好置于37℃培養24 h后統計菌落數；酵母計數采用孟加拉紅培養基(北京奧博星生物技術有限責任公司)平板、霉菌計數采用葡萄糖麥芽浸膏培養基(青島高科園海博生物技術有限公司)平板，接種后置于25℃培養3 d后統計菌落數[15]。

1.4青貯飼料pH測定

采用四分法稱取25 g樣品，加入225 mL的無菌生理鹽水，4℃浸泡12 h后用酸度計(梅特勒-托利多儀器有限公司)測定樣品pH。

1.5統計分析

用SPSS 18.0軟件對試驗數據進行方差分析，并用Duncan法對平均值進行多重比較。

2結果與分析

2.1全株玉米青貯原料中微生物數量及pH

全株玉米灌漿期收割，立即切割成2～4 cm左右，帶回實驗室測定水分含量，晾曬至含水量達到70%左右，青貯前采樣檢測原料中微生物數量和pH。結果發現，青貯原料中好氧細菌數量最多，達到(6.50±1.2)×106cfu/g；乳酸菌和酵母菌次之，分別為(8.61±0.72)×105和(9.62±1.5)×105cfu/g；霉菌較少，為(6.53±1.6)×103cfu/g；pH值為5.55，適合各種有益或有害的微生物生長繁殖。

2.2添加乳酸菌對全株玉米青貯及有氧暴露期乳酸菌數量的影響

由表1可見，在青貯第3天，各處理組和對照組乳酸菌數量快速增加，其中B1-7處理組和B5-2處理組乳酸菌繁殖較快，均在4×107cfu/g以上，與對照組差異顯著(P<0.05)。各組乳酸菌數量在第7天時達到最大，各處理組乳酸菌數量均達到108數量級以上，而對照組乳酸菌數量達到107數量級，各處理組與對照組之間差異顯著(P<0.05)。此后乳酸菌數量逐步減少，第30天時各處理組乳酸菌數量降為106數量級，對照組為105數量級，各處理組乳酸數量均顯著大于對照組，其中B3-1處理組顯著大于其他處理組(P<0.05)。有氧暴露期間各處理組和對照組的乳酸菌數量持續減少，有氧暴露第30天時處理組乳酸菌數量下降為105數量級、對照組為103數量級，各處理組均顯著高于對照組，其中B3-1處理組的乳酸菌數量顯著高于其他處理組(P<0.05)。

2.3添加乳酸菌對全株玉米青貯及有氧暴露期好氧細菌數量的影響

由表2可見，青貯初期各處理組和對照組的好氧細菌數量均不同程度增加，至第7天達到最大，其中只有B3-1處理組好氧細菌數量增加最少，且于第3天即達到最大，與對照組和其他處理組差異顯著(P<0.05)。之后各處理組和對照組的好氧細菌數量逐漸減小，至青貯第30天時減到最小，B3-1處理組最小。整個青貯期各處理組好氧細菌數量均小于對照組，差異顯著(P<0.05)。有氧暴露后，各處理組和對照組的好氧細菌數量均逐漸增加，于第7天時最大，達到107數量級。整個有氧暴露期各處理組好氧細菌數均明顯小于對照組(P<0.05)，其中B3-1處理組始終最小。

表1　添加乳酸菌對全株玉米青貯及有氧暴露期乳酸菌數量的影響

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: The different letters in the same row mean significant differences atP<0.05, the same below.

表2　添加乳酸菌對全株玉米青貯及有氧暴露期好氧細菌數量的影響

2.4添加乳酸菌對全株玉米青貯及有氧暴露期酵母菌數量的影響

由表3可見，青貯初期各處理組和對照組的酵母菌數量均不同程度增加，至第3天達到最大。之后各處理組和對照組的酵母菌數量逐漸減小，至青貯第15天時減到103數量級，其中B3-1處理組最小，與對照組和其他處理組差異顯著(P<0.05)，第30天均檢測不到。整個青貯期各處理組酵母菌數量均小于對照組，差異顯著(P<0.05)。有氧暴露后，各處理組和對照組的酵母菌數量均逐漸增加，于第3天達到103數量級即可檢測到，30 d時最大，達到107數量級。整個有氧暴露期各處理組酵母菌數量均明顯小于對照組(P<0.05)，其中B3-1處理組始終最小，增加最為緩慢。

2.5添加乳酸菌對全株玉米青貯及有氧暴露期霉菌數量的影響

青貯初期各處理組和對照組的霉菌數量差異不明顯，隨著青貯發酵的進行，霉菌數量逐漸減少，在第7天時各組霉菌數量均小于1×102cfu/g。有氧暴露后最初7天，各組的霉菌數量均小于1×102cfu/g，之后快速增加，至第15天對照組達到2.44×105cfu/g，各處理組均比對照少，差異顯著(P<0.05)，其中B3-1處理組只有對照的27.17%。第30天時對照組霉菌數量達到2.48×108cfu/g，顯著高于各處理組(P<0.05)，B3-1處理組的霉菌數量顯著低于其他處理組(表4)。

表3　添加乳酸菌對全株玉米青貯及有氧暴露期酵母菌數量的影響

表4　添加乳酸菌對全株玉米青貯及有氧暴露期霉菌數量的影響

2.6添加乳酸菌對全株玉米青貯及有氧暴露期pH的影響

青貯期和有氧暴露期全株玉米青貯飼料的pH變化見表5，隨著青貯的進行，各處理組和對照組的pH均下降，青貯第3天時各處理組的pH均降到4.0以下，與對照組差異顯著(P<0.05)，對照組于第7天時也降至4.0以下，至青貯第30天一直保持相對穩定，整個青貯過程中，B3-1處理組pH下降最快，最低。有氧暴露后各組pH均有所升高，暴露前7 d各處理組pH上升較為緩慢，只有對照組pH升至4.0以上，上升速度較快。第30天時只有B3-1處理組pH依然在4.0以下，其余各組均升至4.0以上，對照組升至4.69。

表5　添加乳酸菌對全株玉米青貯及有氧暴露期pH的影響

3討論

在作物表面正常附生著大量的微生物，有些是對青貯有利的，比如乳酸菌，但更多是有害的，比如腐敗菌、酵母菌和霉菌等。因此，要想獲得品質優良的青貯飼料，需要青貯原料中的乳酸菌至少達到105cfu/g(鮮質量)[16]。通常，秸稈類作物表面附生的乳酸菌較少，且不一定適合青貯，雖然在本試驗中乳酸菌達到8.61×105cfu/g，但同時，好氧細菌、酵母菌和霉菌數量也很巨大，分別達到6.50×106,9.62×105和6.53×103cfu/g，可能是因為玉米秸稈切割后萎蔫過夜的過程中繁殖所致，這可能會造成營養物質損耗，表明需要改進降低水分含量的方法，減少萎蔫時間。

全株玉米是制作青貯飼料的主要原料，其含糖量較高，青貯較容易，但開窖后容易發生二次發酵，引起青貯飼料腐爛變質，在青貯過程中加入乳酸菌制劑可以提高其青貯發酵品質和有氧穩定性[17]。在青貯過程中，添加乳酸菌的各處理組乳酸菌總數均顯著高于對照組，而好氧細菌、酵母菌和霉菌數量均顯著低于對照組，pH亦低于對照組，說明添加的各乳酸菌均能很好的定植和繁殖，通過產生乳酸抑制有害微生物的繁殖。其中B1-7處理組和B5-2處理組在青貯初期乳酸菌總數最多，可見腸膜明串珠菌B1-7和屎腸球菌B5-2在好氧期繁殖最快。這與Stoked和Chen[18]及Kung和Sheperd[19]的結果一致，腸膜明串珠菌和屎腸球菌在青貯發酵早期迅速生長繁殖，從而為乳酸桿菌的生長創造適宜的條件。但其pH并沒有B3-1處理組低，說明產酸不是最快的，主要是因為腸系膜明串珠菌和屎腸球菌都是異型發酵乳酸菌。從青貯第7天開始到第30天，始終是B3-1處理組乳酸菌總數最多，好氧細菌、酵母菌和霉菌數量最少、pH最低，表明植物乳桿菌B3-1產酸能力最強，耐酸性最好，最具青貯潛能。

有氧暴露后，各處理組和對照組乳酸菌總數隨暴露時間延長逐漸減少，好氧細菌、酵母菌和霉菌數量逐漸增多，pH逐漸升高，但添加乳酸菌的各處理組乳酸菌總數均顯著高于對照組，好氧細菌、酵母菌和霉菌數量均顯著低于對照組，pH亦低于對照組，表明添加的各乳酸菌能不同程度提高全株玉米青貯飼料有氧穩定性。其中B3-1處理組在有氧暴露的30 d內乳酸菌總數始終最多，好氧細菌、酵母菌和霉菌數量最少、pH最低，與對照組差異顯著，表明植物乳桿菌B3-1在提高全株玉米青貯飼料有氧穩定性方面最具潛能。一些研究報道同型乳酸菌發酵提高了青貯發酵的品質，但是在青貯窖打開后，同型乳酸菌發酵不能有效限制酵母菌和霉菌等腐敗菌的繁殖，青貯飼料的有氧穩定性降低[20-21]。本研究結果與之不同可能是因為植物乳桿菌B3-1對供試的金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、沙門菌、大腸桿菌和酵母菌都具有較強的抑菌活性[13]，在有氧環境下，通過抑菌物質抑制有害微生物的活動，減少了二次發酵，但其具體的作用機制還不清楚，有待進一步探討。

pH的高低是決定青貯是否成功的重要指標，pH在4.0以下，青貯飼料品質優等；pH 4.1～4.3，品質良好；pH 4.4～5.0，品質一般；pH在5.0以上，品質劣等[22]。在本試驗中，添加乳酸菌的各處理組于青貯第3天pH均降至4.0以下，而對照組pH為4.21，表明添加乳酸菌可更快產生乳酸，抑制有害微生物的生長，有利于青貯飼料營養價值的保存。對照組于第7天也降至4.0以下，并在此后的青貯過程中各處理組和對照組一直處于4.0以下，均為優等青貯飼料。有氧暴露后，各處理組和對照組的pH隨時間延長均有所升高，但各處理組pH始終低于對照組，于第30天，只有B3-1處理組pH還低于4.0，為優等青貯飼料，而對照組pH已達到4.69，品質一般。

4結論

添加乳酸菌能有效地增加青貯過程和有氧暴露后飼料中乳酸菌的數量，減少好氧細菌、酵母菌和霉菌數量，降低pH，具有提高青貯飼料品質和有氧穩定性的潛力，其中植物乳桿菌B3-1的效果最好。但是，植物乳桿菌B3-1能否作為優良全株玉米青貯接種劑，還需要檢測其對青貯飼料營養成分的影響，再進行綜合判定，我們將后續報道。

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Effect of lactic acid bacteria on corn silage quality and stability after aerobic exposure

WAN Xue-Rui1, WU Jian-Ping2, LEI Zhao-Min2*, HE Yi-Qun1, WU Run1

1.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

Abstract:To investigate the effect of lactic acid bacteria (LAB) with antibacterial activity on the number of LAB, aerobic bacteria, yeasts and molds and pH of whole corn silage during fermentation and aerobic exposure, 5 LAB strains collected from corn silage across Gansu were added to whole corn silage. The results showed that the number of LAB was significantly increased by adding LAB to silage and the number of aerobic bacteria, yeasts and molds significantly reduced and pH reduced after addition of Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides B1-7, Pediococcus pentosaceu B2-3, Lactobacillus plantarum B3-1, Enterococcus faecium B5-2 and Lactobacillus fermentum E2-3 compared with the control (no LAB added). At the beginning of fermentation the number of LAB in B1-7 and B5-2 treatments was highest. After aerobic exposure (7 to 30 days),the number of LAB was highest, aerobic bacteria, yeasts and molds lowest, and pH lowest in the B3-1 strain treatment. These results indicate that all added LAB had a potential role in improving the quality of silage and aerobic stability but L. plantarum B3-1 was the most effective.

Key words:whole corn; silage; Lactobacillus plantarum B3-1; pH

*通信作者

Corresponding author. E-mail：leizm@gsau.edu.cn

作者簡介：萬學瑞(1979-)，女，甘肅白銀人，講師，博士。E-mail：383921499@qq.com

基金項目：甘肅省農業生物技術研究與應用開發項目(GNSW. 2012-25)，農業部公益性行業科研專項(201503134，20130305907)，甘肅省科技支撐計劃(1204NKCA103)，甘肅農業大學盛彤笙科技創新基金(GSAU-STS-1232)和蘭州市科技發展計劃(2012-2-159)資助。

*收稿日期：2015-09-01；改回日期：2015-11-02

DOI：10.11686/cyxb2015397

http://cyxb.lzu.edu.cn

萬學瑞, 吳建平, 雷趙民, 何軼群, 吳潤. 優良抑菌活性乳酸菌對玉米青貯及有氧暴露期微生物數量和pH的影響. 草業學報, 2016, 25(4): 204-211.

WAN Xue-Rui, WU Jian-Ping, LEI Zhao-Min, HE Yi-Qun, WU Run. Effect of lactic acid bacteria on corn silage quality and stability after aerobic exposure. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(4): 204-211.