羊草莖在奶牛瘤胃中降解特性及其對食糜纖維分解菌數量的影響

徐俊，侯玉潔，趙國琦，羅林廣

(1. 江西省農業科學院農產品質量安全與標準研究所，江西 南昌 330200；2. 揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

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羊草莖在奶牛瘤胃中降解特性及其對食糜纖維分解菌數量的影響

徐俊1,2，侯玉潔1,2，趙國琦2*，羅林廣1

(1. 江西省農業科學院農產品質量安全與標準研究所，江西 南昌 330200；2. 揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

摘要：本試驗旨在研究羊草莖降解特性和緊密吸附于莖的3種主要纖維分解菌的動態變化。選用羊草莖為試驗材料，將其縱切6份后裝入尼龍袋投入瘤胃中，分別在6，12，24，48和72 h取出，利用掃描電子顯微鏡觀察超微結構變化；取粉碎后羊草莖進行尼龍袋試驗，分別在0.5，2，6、12，24，48和72 h取出，測定不同時間點中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)降解率和吸附在莖中3種主要纖維分解菌的數量變化。結果表明，薄壁組織和韌皮部可被瘤胃微生物降解，維管束會伴隨薄壁組織的降解而發生脫落。羊草莖和食糜不同時間點纖維分解菌數量均為產琥珀酸絲狀桿菌>白色瘤胃球菌>黃色瘤胃球菌，莖中產琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌數量在24 h達峰值，分別為109和105 copy/g羊草莖，白色瘤胃球菌在12 h達峰值，為108 copy/g羊草莖。瘤胃食糜中3種纖維分解菌的數量在24 h內基本處在一個恒定的水平，而羊草莖NDF降解率在72 h內逐漸提高，羊草NDF降解率與瘤胃食糜中3種纖維分解菌數量不同步，這可能與纖維分解菌分泌的酶活力存在滯后有關。

關鍵詞：羊草莖；纖維分解菌；降解；瘤胃

反芻動物瘤胃棲息著大量微生物，包括細菌、真菌和原蟲等，纖維素可被它們降解形成揮發性脂肪酸為機體供能[1]。瘤胃中88%～91%的葡萄糖內切酶和木聚糖酶，70%的淀粉酶和75%的蛋白酶均由緊密吸附的細菌分泌，因此細菌在細胞壁的降解過程中發揮著十分重要的作用[2]。深入研究緊密吸附在纖維中的細菌對于進一步了解纖維的降解具有十分重要的意義。黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌是瘤胃中3種主要的纖維分解菌[3-4]，前人已通過純培養的方法對其纖維吸附機理進行了大量研究。Mosoni等[5]研究發現，吸附在纖維素上的黃色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌只需45 min即可達到峰值。黃色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌在大麥秸桿(Hordeumvulgare)中的吸附位點各不相同，并且其他非纖維降解菌如棲瘤胃擬桿菌的吸附不影響纖維分解菌的吸附[6]。然而，上述文獻多是通過體外法研究纖維分解菌對纖維的降解，無法獲悉緊密吸附在纖維內部纖維分解菌的數量隨時間的動態變化，并且有關禾本科牧草莖的組織超微結構變化和纖維動態降解率的研究還很少報道。本研究旨在通過尼龍袋技術和掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM)技術研究羊草(Leymuschinensis)莖在奶牛瘤胃中的動態降解及超微結構變化，同時運用實時熒光定量PCR技術研究緊密吸附在羊草莖和瘤胃食糜中產琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌3種主要纖維分解菌的動態變化，為深入研究羊草莖在奶牛瘤胃中的降解規律提供一定的理論依據。

1材料與方法

1.1試驗動物和飼養管理

2013年6月，在揚州大學試驗農牧場選取3頭安裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛(600±15) kg，飼喂主要由玉米青貯、秸稈和精料補充料組成的全混合日糧，栓系式飼養，日喂兩次，自由飲水。

1.2電鏡樣品的制備與觀察

收割揚州大學試驗農牧場種植的長勢和株高相近的抽穗初期羊草3根，剝離得到羊草莖稈部分，在第2節上緣節下2 cm處截取3 cm長片段，縱切為6份，分別放入特制尼龍袋(4 cm×7 cm，孔徑48 μm)中，1個尼龍袋只放1段樣品，分別在6，12，24，48和72 h取出，在水中輕柔沖洗15 min左右，直到流出的水澄清為止，然后按掃描電子顯微鏡觀測要求制備樣品。未放入瘤胃降解的羊草莖于37℃水中浸泡12 h作為對照樣觀察。掃描電鏡的制備參考徐俊等[7]的方法，主要步驟如下：先切除樣品2端1 mm左右片段，以消除邊緣效應，然后截取2個1 mm的片段，放入2.5%的戊二醛溶液中固定24 h，次日倒掉戊二醛溶液，用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，各級乙醇脫水，在1∶1的醋酸異戊酯與乙醇混合液中處理30 min，再用純的醋酸異戊酯處理1 h，經臨界點干燥，最后放樣品臺噴金，用掃描電鏡(XL-30，Phillips)觀察，照相。

1.3莖尼龍袋降解和瘤胃食糜樣品的采集

取羊草莖在65℃下烘干，粉碎過2 mm篩，然后稱取3.00 g樣品(每個時間點2份)放入尼龍袋(8 cm×12 cm，孔徑48 μm)中，于晨飼前投入瘤胃，分別在0.5，2，6，12，24，48和72 h取出，立即放冰水中終止發酵，用冷水沖洗至澄清，然后用力將尼龍袋中的水擠干，-80℃保存，測定NDF降解率和3種主要纖維分解菌的數量。同時采集奶牛飼喂后2，6，12和24 h的瘤胃食糜樣品，-80℃保存測定纖維分解菌數量。

1.4纖維分解菌實時熒光定量PCR

取羊草莖和瘤胃食糜樣品，分別按照OMEGA植物DNA和糞便DNA提取試劑盒操作說明提取總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計分析DNA質量及其濃度，本試驗測定的纖維分解菌包括黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌，3種纖維分解菌的引物設計如表1所示。PCR產物通過PMD18-T載體連接，然后轉入大腸桿菌細胞，根據Omega質粒提取試劑盒提取質粒DNA，送北京信諾金達公司測序分析，序列結果在NCBI上進行比對分析，并利用分光光度計測定質粒中DNA濃度，計算質粒拷貝數。對質粒DNA溶液進行10倍系列稀釋，利用 TaKaRa SYBR Green Ⅱ進行實時熒光定量PCR反應，采用20 μL反應體系，反應條件為：95℃預變性2 min，95℃30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環。根據拷貝數和對應的Ct值建立標準曲線，對羊草和瘤胃食糜樣品中的DNA拷貝數進行定量，然后對每克樣品中微生物基因拷貝數取對數值[log copy/g DM stem (digesta)]，計算參照楊金麗等[8]的方法。

表1　細菌名稱和引物序列

1.5數據分析

試驗結果用Microsoft Excel 2007整理，采用SPSS 17.0中的One-Way Anova進行方差分析，并用Duncan法做多重比較，結果以“平均數±標準差”表示，以P<0.05作為差異顯著性標準。

2結果與分析

2.1掃描電鏡下羊草莖超微結構變化

圖1顯示了掃描電鏡下羊草莖在奶牛瘤胃內降解0～72.0 h的超微結構變化圖。6 h時，羊草莖表面吸附有大量微生物；12 h時，韌皮部組織出現明顯的降解(圖1C箭頭所示)；到24 h時，薄壁組織大部分已被降解；72 h后維管束組織一直未被降解，伴隨薄壁組織的降解而發生脫落，羊草莖表皮和厚壁組織基本不降解，72 h后仍保持完整。

2.2羊草莖中纖維分解菌的數量變化

羊草莖緊密吸附的3種主要纖維分解菌在0.5～72.0 h的數量變化如圖2所示。由圖可知，在不同時間點，3種纖維分解菌數量都是產琥珀酸絲狀桿菌>白色瘤胃球菌>黃色瘤胃球菌，降解0.5 h后，上述3種纖維分解菌的數量分別達到107，103和106copy/g羊草莖。細菌在羊草莖降解的前2 h吸附速度最快，產琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌的數量均在24 h達到峰值，分別為109和105copy/g羊草莖，白色瘤胃球菌數量是在12 h達到峰值，為108copy/g羊草莖。72 h后吸附的纖維分解菌數量相比于各自細菌的峰值都有所下降，且黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的數量都是顯著降低(P<0.05)。

2.3羊草莖NDF動態降解率

羊草莖72 h內NDF動態降解率如圖3所示。NDF在前6 h降解速率十分緩慢，這與莖在瘤胃中掃描電鏡圖片得到的降解結果一致，組織結構前6 h變化不明顯，主要是發生細菌的附著。在12～48 h期間，羊草莖薄壁組織開始大量降解，48 h后降解率達到35.89%，隨著時間的推移仍在平緩上升，72 h后達到38.78%。與此同時，由掃描電鏡可知，72 h后維管束組織將會發生脫落，羊草莖NDF降解率仍會提高。

2.4瘤胃中纖維分解菌的數量變化

瘤胃食糜中3種纖維分解菌24 h內的數量變化如圖4所示，與羊草莖中纖維分解菌的數量類似，食糜中3種纖維分解菌的數量也是產琥珀酸絲狀桿菌>白色瘤胃球菌>黃色瘤胃球菌，上述3種細菌的數量均值為109,106和104copy/g食糜。 黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的數量在24 h內各時間點均無顯著差異(P>0.05)， 產琥珀酸絲狀桿菌是6 h時的數量顯著高于其他3個時間點(P<0.05)，總體而言，瘤胃中不同時間點3種纖維分解菌的數量十分穩定。

圖1　羊草莖在瘤胃中降解后的掃描電鏡圖片Fig.1　The structure dynamic changes of L. chinensis stems observed under scanning electron microscope　Epi：對照樣品中(0 h)表皮Epidermis；S：厚壁組織Sclerenchyma；V：維管束Vascular；B：維管束鞘Bundle sheath； P：韌皮部phloem；Par：薄壁組織Parenchyma.

圖2　羊草莖中緊密吸附的產琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌隨時間的數量變化Fig.2　Time course of fiber-associated cell number of F. succinogenes, R. flavefaciens, R. albus from 0.5 to 72 h incubation

圖3　羊草莖中性洗滌纖維瘤胃72 h降解率Fig.3　NDF digestibility of L. chinensis stem during in situ incubation for 72 h

不同字母代表相同細菌不同時間點差異顯著(P<0.05)，下同。 Different letters mean the significant differences atP<0.05，the same below.

3討論

羊草作為禾本科牧草，細胞壁組織結構和豆科牧草(如苜蓿)存在一定的差異，苜蓿表皮和厚角組織可以完全被瘤胃微生物降解，但羊草組織結構中的表皮和厚壁組織在72 h后仍保持完好[7]。羊草組織結構與同為禾本科的燕麥草類似，都是由表皮、厚壁組織、薄壁組織和維管束等結構組成。但羊草細胞壁結構相比于燕麥草更加致密，這也許是導致其降解速率慢、 NDF降解率低的原因，燕麥草中的維管束在48 h后幾乎全部伴隨薄壁組織的降解而脫落[9]，但羊草組織中維管束降解72 h后仍未發生脫落，燕麥草莖在48和72 h的NDF降解率分別為40.23%和43.11%，均分別高于羊草的35.89%和38.78%。羊草莖NDF主要包括纖維素、半纖維素和難降解的木質素，羊草細胞壁中非木質化的薄壁組織可被瘤胃內纖維分解菌降解，但木質化程度高的厚壁組織和表皮則無法降解[10]，這是因為木質素可與細胞壁中的多糖形成動物體內的酶難以降解的復合體，限制動物機體對植物細胞壁成分的消化吸收[11]。

圖4　奶牛瘤胃中24 h內產琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的數量變化Fig.4　The diurnal changes of F. succinogenes, R. flavefaciens　　 and R. albus in the rumen of cows

在瘤胃微生物中，細菌和真菌可以分泌多種活性很高的纖維降解酶，它們占降解纖維酶活力的80%以上，但由于真菌在總微生物中含量較低(約8%)，對纖維降解的貢獻不如細菌大，瘤胃中細菌在對纖維的降解過程中起到了決定性作用，尤其是與飼料顆粒緊密吸附的細菌[12]。研究發現，細菌可以快速附著于黑麥草，且在薄壁組織和韌皮部中的細菌吸附量最多，尤其是黃色瘤胃球菌[13]，本試驗中羊草組織結構的降解與之類似，但各時間點均以產琥珀酸絲狀桿菌的附著量最多，而非黃色瘤胃球菌，這可能與試驗材料和試驗動物不同有關。Koike等[14]選擇鴨茅(Dactylisglomerata)莖為試驗材料，通過競爭性PCR研究了綿羊中3種主要纖維降解菌對鴨茅莖的降解規律，結果表明,在培養5 min后，產琥珀酸絲狀桿菌和其他兩種球菌的數量可達到105和104copy/g DM，10 min后各細菌數量增加了10倍，且24 h時產琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌數量達到峰值，分別為109和107copy/g DM，而白色瘤胃球菌需要48 h才達到峰值(106copy/g DM)。此外，產琥珀酸絲狀桿菌是瘤胃食糜和鴨茅莖降解中最重要的細菌，本試驗結果與上述研究相吻合，但是白色瘤胃球菌在12 h即達到峰值108copy/g DM，且羊草莖和瘤胃食糜中的白色瘤胃球菌數量顯著高于黃色瘤胃球菌。

羊草莖NDF降解率隨著時間的延長逐漸上升，但與莖中緊密吸附的纖維分解菌數量并不同步，該結果與Koike等[14]報道的結果一致，緊密吸附于纖維的細菌在降解NDF之前還會利用其他底物，如可溶性碳水化合物，與此同時，體外法研究表明，纖維素酶的分泌是由纖維素和木聚糖誘導產生的，這可能是造成NDF降解率與纖維分解菌不同步的主要原因。由瘤胃食糜中3種纖維分解菌的數量變化可知，產琥珀酸絲狀桿菌在食糜和羊草莖中均占據主導地位，該結果與Koike和Kobayashi[3]報道的結果一致，綿羊瘤胃中產琥珀酸絲狀桿菌數量均高于其他兩種球菌數量，而與綿羊采食的日糧無關[15-16]，盡管有報道發現高精料日糧條件會降低瘤胃中產琥珀酸絲狀桿菌數量[17]。然而，也有研究表明奶牛瘤胃中白色瘤胃球菌數量比產琥珀酸絲狀桿菌更多，且研究還發現不同動物種類也會影響纖維分解菌的群落結構[18]。

4結論

通過對羊草莖組織結構和NDF動態降解率以及緊密吸附的3種主要纖維分解菌的數量變化的研究表明，羊草莖薄壁組織可被降解，但降解速率較慢，細菌可快速吸附于纖維組織，NDF降解率隨著時間的延長不斷提高，但與瘤胃食糜中的纖維分解菌數量不同步，這可能與纖維分解菌分泌的酶活力滯后有關。

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Kinetics of in situ degradation ofLeymuschinensisstems in the dairy cow rumen and changes in cellulolytic bacteria in digesta

XU Jun1,2, HOU Yu-Jie1,2, ZHAO Guo-Qi2*, LUO Lin-Guang1

1.InstituteofQualitySafetyandStandardsofAgriculturalProducts,JiangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanchang330200,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China

Abstract:In this study, we investigated the degradation characteristics of Leymus chinensis stems in the dairy cow rumen and evaluated the changes in cellulolytic bacteria during the degradation process. L. chinensis stems were cut and packed into six nylon bags, which were incubated for 6, 12, 24, 48, and 72 h in the rumen of a dairy cow. Changes in the ultra-structure of L. chinensis stems during digestion in the rumen were evaluated by scanning electron microscopy. L. chinensis stems incubated for 0.5, 2, 6, 12, 24, 48, and 72 h in the rumen were evaluated to determine their neutral detergent fiber (NDF) digestibility. The cellulolytic bacteria in these digesta samples were also analyzed. The results showed that the non-lignified parenchymal tissue and phloem were quickly degraded and the vascular bundle was released from the plant tissues after degradation of the parenchymal tissue. The main bacterial species attached to the stem tissues were Fibrobacter succinogenes>Ruminococcus albus>Ruminococcus flavefaciens. The numbers of these bacteria peaked at 24 h (109/g dry matter for F. succinogenes and 105/g for R. flavefaciens) or 12 h (108/g DM for R. albus) of digestion in the rumen. The numbers of cellulolytic bacteria in digesta remained constant after 24 h, while the disappearance of NDF from the L. chinensis stems showed a linear increase up to 72 h of digestion. These results suggest that the disappearance of NDF from the L. chinensis stem is not synchronized with changes in the populations of cellulolytic bacteria in digesta, and may instead be related to a delayed increase in the activities of fibrolytic enzymes.

Key words:Leymus chinensis stem; cellulolytic bacteria; degradation; rumen

*通信作者

Corresponding author. E-mail：gqzhao@yzu.edu.cn

作者簡介：徐俊(1986-)，男，江西南昌人，助理研究員。E-mail:xujun0125@163.com

基金項目：十二五國家科技支撐計劃(2011BAD17B03)和國家自然科學基金(31560647)資助。

*收稿日期：2015-06-10；改回日期：2015-08-24

DOI：10.11686/cyxb2015298

http://cyxb.lzu.edu.cn

徐俊, 侯玉潔, 趙國琦, 羅林廣. 羊草莖在奶牛瘤胃中降解特性及其對食糜纖維分解菌數量的影響.草業學報, 2016, 25(4): 166-171.

XU Jun, HOU Yu-Jie, ZHAO Guo-Qi, LUO Lin-Guang. Kinetics of in situ degradation ofLeymuschinensisstems in the dairy cow rumen and changes in cellulolytic bacteria in digesta. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(4): 166-171.