喉癌組織糖原合成酶激酶3β、T細胞因子4表達及意義

魏金龍，劉鳴，王蘇亮，趙治明，楊艷，李晶，袁雪

(1哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，哈爾濱150001；2齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院)

喉癌組織糖原合成酶激酶3β、T細胞因子4表達及意義

魏金龍1,2，劉鳴1，王蘇亮2，趙治明2，楊艷2，李晶2，袁雪2

(1哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，哈爾濱150001；2齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院)

目的 探討糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)和T細胞因子4(TCF-4)在喉癌發生、發展中的作用。方法 采用免疫組織化學法檢測45例喉癌患者喉癌組織(觀察組)及其癌旁正常組織(對照組)GSK-3β和TCF-4的表達情況，分析喉癌組織GSK-3β、TCF-4陽性表達與患者臨床病理參數的關系，探討喉癌組織GSK-3β與TCF-4表達的關系。結果 觀察組與對照組GSK-3β陽性表達率分別為86.67%、22.22%， TCF-4陽性表達率分別為80.00%、15.56%；兩組比較P均<0.05。TCF-4、GSK-3β陽性表達均與喉癌組織分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關(P均<0.05)，與患者性別、年齡和腫瘤分型均無關(P均>0.05)。GSK-3β和TCF-4表達無相關性(r=0.292，P>0.05)。結論 喉癌組織GSK-3β、TCF-4高表達可促進喉癌的發生、發展。

喉癌；糖原合成酶激酶3β；T細胞因子4；Wnt信號傳導通路

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，近年來發病率逐年升高[1]，但其發病機制尚未明確。研究發現，Wnt信號通路的信號表達異常與多種腫瘤的發生、發展關系密切[2,3]。糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)和T細胞因子4(TCF-4)是Wnt信號通路中重要的信號分子。非小細胞肺癌組織中GSK-3β表達顯著下降，影響β-鏈蛋白(β-catenin)的磷酸化降解過程[4]，導致過量的β-catenin進入細胞核，與核內TCF-4特異性結合，激活Wnt靶基因啟動子的轉錄過程，促進腫瘤的發生、發展。本研究觀察喉癌組織中GSK-3β和TCF-4的表達情況，探討Wnt信號通路在喉癌發生、發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月～2015年12月齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院診治的喉癌患者45例，男36例、女9例，年齡29～75(55.8±11.7)歲，均為鱗狀細胞癌，其中聲門型22例、聲門上型19例、聲門下型4例；根據美國癌癥聯合委員會(AJCC)2002年制定的喉癌TNM分期標準，Ⅰ期6例、Ⅱ期20例、Ⅲ期16例、Ⅳ期3例。均經手術治療，術中取病理組織明確診斷；術中分別取喉癌組織0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm作為觀察組，取距腫瘤邊緣≥3 cm處同樣大小正常黏膜組織作為對照組。納入標準：原發性喉癌；首次確診為喉癌，術前未接受放療、化療、生物治療等；臨床資料完整。排除標準：合并內分泌疾病；確診前曾使用雌激素或抗雌激素藥物；合并其他原發性腫瘤。本研究通過我院倫理委員會批準，研究對象對本研究均知情同意。

1.2 GSK-3β、TCF-4表達檢測 將兩組標本經4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，制成厚度為3～5 μm厚的切片，于60 ℃環境中烘烤12 h；脫蠟，入水；0.1 mol/L PBS沖洗，滴加山羊血清，室溫下封閉20 min；滴加兔抗人TCF-4單克隆抗體(1∶150)、兔抗人GSK-3β單克隆抗體(1∶100)于4 ℃培養12 h；PBS沖洗后滴加生物素化二抗(IgG)，37 ℃培養20 min；用PBS沖洗后滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，DAB試劑盒顯色，蘇木素復染，封片。實驗步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行。GSK-3β陽性表達定位于細胞質，呈棕黃色；TCF-4陽性表達定位于細胞質和細胞核，呈棕黃色。400倍鏡下隨機選取5個互不重疊的視野，計數視野內細胞數及陽性細胞數。陽性細胞百分比評分：<5%為0分，≥5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～80%為3分，>80%為4分；細胞染色程度評分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。兩項評分相乘為0～4分為陰性，5～7分為弱陽性，8～12分為強陽性。弱陽性、強陽性均記為陽性。分析喉癌組織GSK-3β、TCF-4陽性表達與患者臨床病理參數的關系。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GSK-3β、TCF-4表達 觀察組GSK-3β表達陰性6例、弱陽性24例、強陽性15例，陽性表達率為86.67%；對照組分別為36、9、1例及22.22%；觀察組陽性表達率高于對照組(P<0.05)。觀察組TCF-4表達陰性9例、弱陽性17例、強陽性19例，陽性表達率為80.00%；對照組分別為38、6、1例及15.56%；觀察組陽性表達率高于對照組(P<0.05)。見插頁Ⅲ圖6。

2.2 喉癌組織TCF-4、GSK-3β陽性表達與患者臨床病理參數的關系 喉癌組織TCF-4、GSK-3β陽性表達與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結轉移均有關(P均<0.05)，與患者性別、年齡和腫瘤分型均無關(P均>0.05)。見表1。

表1 喉癌組織TCF-4、GSK-3β表達與患者臨床病理參數的關系(例)

2.3 喉癌組織中GSK-3β與TCF-4陽性表達的關系 喉癌組織中GSK-3β和TCF-4陽性表達無相關性(r=0.292，P>0.05)。

3 討論

導致喉癌發生的因素有很多，如吸煙、空氣污染等環境因素及信號通路異常等分子生物學因素等[5]。Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高度保守的信號通路。Wnt信號通路傳導異常與多種腫瘤的發生均關系密切。李冬等[6]利用香煙煙霧對肺癌小鼠模型進行刺激，發現小鼠肺癌組織中TNF-α和β-catenin表達顯著升高，繼而通過Akt/GSK-3β途徑激活Wnt/β-catenin信號通路。Wnt信號通路通過Wnt蛋白與細胞表面的Frizzled受體結合，導致細胞質中的Dishevelled蛋白接受上游信號，抑制細胞質中腺瘤性結腸息肉病蛋白(APC)、軸蛋白(Axin)和GSK-3β之間形成復合物，從而避免細胞質內β-catenin被大量降解，導致多余的β-catenin進入細胞核，與其內的TCF-4結合，啟動下游靶基因的轉錄[7]；此通路上任何一個位點發生變異，均可能導致腫瘤的發生。

本研究發現，喉癌組織GSK-3β、TCF-4陽性表達率均顯著高于癌旁正常黏膜組織，TCF-4、GSK-3β陽性表達均與喉癌分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關，與Li等[8]研究結果相似，提示Wnt信號通路異常參與喉癌的發生、發展。原因可能為喉癌細胞內APC基因發生突變，導致體內合成的APC蛋白不具有與β-catenin、GSK-3β形成復合物的能力[9，10]。GSK-3β作為Wnt通路中重要的的負性調節因素，可以將β-catenin中的絲氨酸和蘇氨酸位點磷酸化，使β-catenin大量降解，從而沉默Wnt通路[11，12]。GSK-3β亦可使APC發生磷酸化，降解β-catenin，沉默Wnt通路[13,14]。當存在Wnt信號刺激時，喉癌細胞質內大量β-catenin蓄積，并與核內的TCF-4結合，形成的復合體激活Wnt靶基因，促使其發生轉錄，促進腫瘤細胞的增殖。結合上述研究結果，推測雖然喉癌組織GSK-3β蛋白陽性表達率顯著高于癌旁正常黏膜組織，但絕大部分處于失活狀態，無法在細胞質內形成APC-GSK-3β-Axin復合體，無法降解細胞質中的β-catenin，故仍然有大量β-catenin進入細胞核，進而激活TCF-4/LEF-1通路，啟動喉癌靶基因，促進癌癥的發生。本研究喉癌組織中GSK-3β和TCF-4表達無相關性，也間接支持上述推論。Wang等[15]認為，細胞質中GSK-3β被磷酸化可導致其失活；Cuilliere-Dartigues等[16]則認為，喉癌發生過程中可能存在其他通路導致TCF-4水平異常升高；但GSK-3β失活的確切機制有待進一步研究。

綜上所述，喉癌組織GSK-3β、TCF-4陽性表達顯著升高，二者高表達導致Wnt信號傳導通路異常，進而促進喉癌的發生、發展，但其具體作用機制有待進一步研究。

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齊齊哈爾市科學技術研究與發展計劃項目(SFGG201446)；哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研項目。

劉鳴(E-mail： 244544098@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.021

R739.6

B

1002-266X(2016)28-0060-03

2016-01-22)