孟魯司特對哮喘大鼠氣道炎癥的調控作用及其機制

鄧俊，楊艷，梁宇佳，熊瑛，王宋平，熊彬

(四川醫科大學附屬第一醫院，四川瀘州646000)

孟魯司特對哮喘大鼠氣道炎癥的調控作用及其機制

鄧俊，楊艷，梁宇佳，熊瑛，王宋平，熊彬

(四川醫科大學附屬第一醫院，四川瀘州646000)

目的 觀察孟魯司特對哮喘大鼠氣道炎癥的調控作用，并探討其可能的作用機制。方法 將30只雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、孟魯司特組、地塞米松組和聯合用藥組，每組6只。對照組腹腔注射和霧化吸入生理鹽水，其余各組均采用卵清白蛋白腹腔注射致敏及霧化吸入激發的方法制備哮喘模型。孟魯司特組、地塞米松組每次激發前分別給予孟魯司特(15 mg/kg)、地塞米松(2 mg/kg)灌胃，聯合用藥組每次激發前給予等量孟魯司特和地塞米松灌胃，1次/d，連用10天。收集各組支氣管肺泡灌洗液(BALF)，計數WBC、嗜酸性粒細胞(EOS)、中性粒細胞(PMN)、淋巴細胞(LYM)。取右肺組織行HE染色，觀察其病理變化，采用免疫組化SP法檢測肺組織上皮細胞信號轉導子和轉錄激活子3(STAT3)、瘦素(Leptin)及IL-6表達。結果 與對照組比較，其余各組BLAF中WBC、EOS、PMN、 LYM計數和肺組織STAT3、Leptin、IL-6表達均升高(P均<0.05)；與模型組比較，孟魯司特組、地塞米松組和聯合用藥組上述指標均降低，但聯合用藥組降低更明顯(P均<0.05)。對照組肺組織形態正常，模型組有明顯的氣道炎癥病理表現，孟魯司特組、地塞米松組和聯合用藥組肺組織病理表現介于對照組和模型組之間，且聯合用藥組炎性程度輕于孟魯司特組和地塞米松組。結論 孟魯司特能減輕哮喘大鼠的氣道炎癥狀態，與糖皮質激素聯用具有協同抗炎作用；其抗炎機制可能與抑制肺組織STAT3、Leptin及IL-6表達有關。

哮喘；氣道炎癥；孟魯司特；地塞米松；大鼠

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細胞[如嗜酸性粒細胞(EOS)、淋巴細胞(LYM)、中性粒細胞(PMN)]和細胞組分共同參與的氣道慢性炎癥性疾病。研究表明，瘦素(Leptin)和IL-6具有促進炎癥反應和免疫調節作用，信號轉導子和轉錄激活子3(STAT3)在哮喘的發生、發展過程中具有重要作用[1,2]。白三烯受體拮抗劑可通過調節白三烯的生物活性，抑制氣道上皮細胞分泌細胞因子和EOS存活而發揮抗炎作用[3,4]。孟魯司特是臨床上常用的白三烯受體拮抗劑，可與糖皮質激素協同發揮抗炎作用，但其具體機制尚未完全闡明[5,6]。為此，我們于2013年8月～2014年8月進行了相關研究。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠30只，6周齡，體質量150～200 g，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXW(渝)2007-2008。孟魯司特購自杭州默沙東制藥有限公司，地塞米松片購自山西亨瑞達制藥有限公司。卵清白蛋白(OVA)購自美國Sigma公司，氫氧化鋁干粉購自北京化學試劑三廠，兔抗鼠Leptin免疫組化試劑盒購自美國Santa Cruz公司，兔抗鼠IL-6免疫組化試劑盒購自美國Bioss公司，兔抗鼠STAT3免疫組化試劑盒購自美國Bioworld公司。

1.2 模型制備及分組處理 將30只雄性SD大鼠適應性飼養3天，隨機分為對照組、模型組、孟魯司特組、地塞米松組、聯合用藥組，每組6只。除對照組外，其余各組分別于造模第1、7天腹腔注射含氫氧化鋁200 mg+OVA 100 mg的生理鹽水混懸溶液1 mL；造模第15天開始霧化吸入1% OVA 30 mL進行激發，30 min/次，1次/d，連用10天。對照組采用同樣方法腹腔注射和霧化吸入等量生理鹽水。孟魯司特組每次激發前1.5 h，將孟魯司特15 mg/kg溶于10 mL生理鹽水中灌胃；地塞米松組每次激發前30 min，將地塞米松2 mg/kg溶于10 mL生理鹽水中灌胃；聯合用藥組采用同樣方法給予等量地塞米松和孟魯司特灌胃，對照組、模型組給予等量生理鹽水灌胃。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞計數 各組于末次激發24 h進行麻醉，常規消毒鋪巾，打開腹腔，腹主動脈放血。然后打開胸腔，分離氣管及肺葉，結扎右側肺門，左肺行支氣管肺泡灌洗。將針管插入氣管并緩慢注入生理鹽水2 mL，回抽BALF，重復3次，回收率>85%為合格標本，計數每升BALF中WBC總數。將BALF以1 500 r/min離心10 min，離心沉淀后用1 mL生理鹽水重懸，取細胞懸液制作涂片，計數EOS、PMN、LYM。

1.3.2 肺組織病理變化 取各組右肺組織，10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚切片。二甲苯脫蠟后，經不同梯度乙醇脫水，蘇木素染色5 min，自來水沖洗；鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，置于伊紅染液2 min；乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下(400倍)觀察肺組織病理變化。

1.3.3 肺組織Leptin、STAT3及IL-6表達 采用免疫組化SP法。肺組織石蠟包埋、切片，60 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。PBS(pH=7.2)沖洗3次×5 min，置于3% H2O2中，37 ℃孵育10 min；0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)中煮沸，PBS沖洗3次×5 min。室溫滴加山羊血清封閉，37 ℃孵育10 min；加入兔抗鼠一抗，置于濕盒4 ℃孵育過夜，以PBS代替一抗作陰性對照。PBS沖洗3次×5 min，滴加生物素標記羊抗兔二抗，室溫靜置20 min，PBS沖洗3次×5 min。以辣根過氧化物酶標記鏈霉素卵白素，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次×5 min；二氨基聯苯胺染色，自來水沖洗，蘇木素復染2 min。1%鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下陽性細胞呈棕黃色或黃褐色染色。采用雙盲法評分，每張切片觀察3個高倍鏡視野，染色強度評分：無染色為0分、輕度染色為1分、中度染色為2分、強度染色為3分；染色細胞所占比例評分：無細胞染色為0分、<25%為1分、25%～50%為2分、>50%為3分。肺組織Leptin、STAT3及IL-6的表達以染色強度評分和染色細胞所占比例評分之和表示。

2 結果

2.1 各組BLAF中WBC、EOS、PMN、 LYM計數比較 與對照組比較，其余各組BLAF中WBC、EOS、PMN、 LYM計數均升高(P均<0.05)；與模型組比較，孟魯司特組、地塞米松組和聯合用藥組BLAF中WBC、EOS、PMN、 LYM均降低，但聯合用藥組降低更明顯(P均<0.05)。見表1。

表1 各組BLAF中WBC、EOS、PMN、 LYM計數比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與孟魯司特組比較，#P<0.05；與地塞米松組比較，▲P<0.05。

2.2 各組肺組織病理變化 對照組氣道上皮完整、無水腫，纖毛無脫落，肺泡腔內未見滲出，氣道黏膜下未見炎性細胞浸潤，支氣管平滑肌未見增厚。模型組氣道上皮腫脹，纖毛脫落，杯狀細胞增多，黏液分泌增多，細小支氣管內可見黏液栓；氣道黏膜下可見炎性細胞浸潤，肺泡腔內可見炎性滲出，上皮下毛細血管擴張、充血，周圍組織水腫。孟魯司特組、地塞米松組和聯合用藥組肺組織病理形態介于對照組和模型組之間，且聯合用藥組炎性程度輕于孟魯司特組和地塞米松組。見插頁Ⅱ圖6。

2.3 各組肺組織STAT3、Leptin、IL-6表達比較 與對照組比較，其余各組肺組織STAT3、Leptin及IL-6表達均升高(P均<0.05)；與模型組比較，孟魯司特組、地塞米松組和聯合用藥組肺組織STAT3、Leptin及IL-6表達均降低，且聯合用藥組降低更明顯(P均<0.05)。見表2。

表2 各組肺組織STAT3、Leptin、IL-6表達比較(分

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與孟魯司特組比較，#P<0.05；與地塞米松組比較，▲P<0.05。

3 討論

哮喘的病理特征主要為氣道上皮下EOS、LYM、PMN等炎性細胞浸潤，氣道黏膜下組織水腫，微血管通透性增加，杯狀細胞增多，氣道黏液分泌增多等[7,8]。本研究模型組肺組織的病理改變與哮喘氣道炎癥的基本病理特征相符合，表明采用OVA致敏及霧化吸入激發的方法制備大鼠哮喘模型成功。

近年研究表明，氣道上皮細胞在哮喘的發病中具有重要作用，氣道上皮損傷與氣道慢性炎癥、氣道高反應性和氣道重塑密切相關；當氣道受到環境激發因子刺激時，氣道上皮細胞首先受累，可合成和釋放多種炎癥介質和細胞因子[9～11]。STAT3是STAT家族的一員，主要介導細胞內外信號的轉導。STAT3可啟動Th17分化，使氣道上皮細胞和平滑肌細胞分泌IL-6等細胞因子，促使中性粒細胞分化，加重氣道炎癥，在哮喘的發生、發展中具有重要作用[12～14]。Leptin是一種脂肪細胞因子蛋白多肽，其主要作用是調節攝食活動及能量平衡，還可促進炎癥反應和調節免疫。Leptin主要與其功能受體瘦素受體b型結合，并通過JAK-STAT3信號途徑發揮作用[1,15]。

孟魯司特是臨床常用的白三烯受體拮抗劑，主要通過抑制白三烯的生物活性而發揮抗炎作用，是目前除吸入型糖皮質激素外惟一可單獨應用的哮喘控制性藥物，也可作為中重度哮喘的聯合治療用藥[3,16]，但其抗炎機制尚未完全闡明。有研究發現，孟魯司特能抑制其他促炎癥因子的表達而減輕氣道炎癥反應[5,6]，抑制EOS誘導的氣道上皮間質轉化和促纖維化因子TGF-β1表達，從而抑制氣道重塑[17,18]。本研究結果顯示，孟魯司特組和地塞米松組氣道炎癥程度及炎癥細胞浸潤均輕于模型組，且兩者聯合用藥抗炎效果更好，提示孟魯司特和糖皮質激素具有協同抗炎作用；與模型組比較，孟魯司特組、地塞米松組和聯合用藥組肺組織STAT3、Leptin及IL-6表達均降低，但聯合用藥組降低更明顯，進一步證實孟魯司特和糖皮質激素具有協同抗炎作用，其抗炎機制可能與其抑制肺組織STAT3、Leptin及IL-6表達有關。

綜上所述，孟魯司特能減輕哮喘大鼠的氣道炎癥狀態，與糖皮質激素聯用具有協同抗炎作用；其抗炎機制可能與抑制肺組織STAT3、Leptin及IL-6表達有關。本研究為白三烯受體拮抗劑單獨應用或與糖皮質激素聯合應用治療哮喘提供了理論依據。

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四川省衛生廳科研課題(110341)。

王宋平(E-mail: wang4816@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.011

R562.1

A

1002-266X(2016)24-0034-03

2015-10-14)