曼陀羅總生物堿提取的工藝優化

尚天翠，衛剛，劉影（.伊犁師范學院自治區教育廳普通高等學校重點實驗室，新疆伊寧835000；.新疆伊寧衛生學校專業基礎學科，新疆伊寧835000）

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曼陀羅總生物堿提取的工藝優化

尚天翠1，衛剛2，劉影1
（1.伊犁師范學院自治區教育廳普通高等學校重點實驗室，新疆伊寧835000；2.新疆伊寧衛生學校專業基礎學科，新疆伊寧835000）

摘要：采用乙醇回流法提取曼陀羅總生物堿，并對提取條件進行優化。首先采用單因素試驗考察料液比、提取時間、提取溫度、pH等因素對曼陀羅總生物堿提取效果的影響，再以此四因素進行L9（34）正交試驗以確定最佳工藝條件。結果表明：曼陀羅中總生物堿的最佳提取工藝條件為提取溫度60℃、提取時間2 h、提取劑乙醇濃度75 %、料液比1∶15（g/mL）。

關鍵詞：曼陀羅；總生物堿；提取

曼陀羅（Datura stramonium L.）又稱醉心花、洋金花等，為茄科曼陀羅屬植物。我國各省區均產，常生于村邊、路邊和草地，含生物堿、黃酮、多糖、亞油酸等多種有效成分[1-5]，其中有效成分主要為生物堿，具有治療關節痛、哮喘、咳嗽、胃腸痙攣、神經性偏頭痛、跌打損傷等癥[6-9]?，F代醫學和臨床研究發現，曼陀羅具有多種生物活性，醫學上可廣泛應用于多種疾病的治療以及農林業上對多種病蟲鼠害的防治[10-13]。

我國曼陀羅資源豐富，價廉易得，為可開發的天然藥用植物資源。本研究采用索氏回流法提取曼陀羅中總生物堿，通過L9（34）正交試驗對曼陀羅總生物堿的最佳提取工藝條件進行了優化，旨在尋求一種快速、簡便、高效、對工業生產有參考價值的提取曼陀羅中總生物堿的方法。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

曼陀羅植株在2010年9月采集于伊寧市上海城周邊地區。將新鮮植株剪去葉片、花果枝和根，剩余莖桿用蒸餾水沖洗干凈。經60℃烘干后粉碎，過40目篩，裝入塑封袋中低溫保存備用。

無水乙醇、碘化鉍鉀、溴水、濃硫酸、鎂粉、α-萘酚、硫酸鈉、甲醇、乙酸鎂、濃硫酸、甲醛均為國產分析純。

1.2儀器與設備

0.1mg～220 g電子天平：北京賽多利斯系統儀器有限公司；FW-80高速萬能粉碎機；8401—2A型數顯遠紅外高溫干燥箱：杭州藍天化驗儀器廠；，HH-S8電熱恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；UV-2600PC紫外分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1曼陀羅生物堿的提取工藝流程

新鮮曼陀羅→烘干→粉碎→提取→濃縮→酸水溶解→堿化→萃取→稀釋→鑒定→測吸光度

1.3.2生物堿提取液的鑒定

生物堿在中性或酸性條件下，與某些沉淀試劑反應生成弱酸不溶性復鹽或絡合物沉淀[14]，生物堿的沉淀反應能對曼陀羅生物堿進行靈敏檢測，本試驗通過沉淀反應和顯色反應對提取液進行定性分析。

將曼陀羅提取液分裝入6個試管分別用碘化鉍鉀、溴水、甲醛-濃硫酸、1 %乙酸鎂甲醇、5 %α-萘酚乙醇溶液等試劑鑒定[15-16]。

1.3.3最大吸收峰波長的確定

稱取2 g粉碎的曼陀羅粉末，在提取溫度為60℃的條件下，用30 mL 75 %乙醇溶劑回流提取2 h，濃縮，將上述濃縮液加水50 mL，加熱溶解并調pH為2～3，過濾，氨試液堿化，用氯仿提取3次，回收氯仿稀釋500倍后在紫外分光光度計上進行全波段掃描，以乙醇溶液為對照試驗，確定其最大吸收波長。

1.3.4單因素試驗

1.3.4.1提取溫度篩選

稱取2 g曼陀羅粉末，共5份，分別放入50 mL的回流瓶中，編號，再分別加入30 mL 75 %的乙醇，分別于40、50、60、70、80℃的條件下回流提取2 h，濃縮，將上述濃縮液加水50 mL，加熱溶解并調pH為2～3，過濾，氨試液堿化，用氯仿提取3次，回收氯仿稀釋后，在249.80 nm處測其吸光度。

1.3.4.2提取時間篩選

稱取2 g曼陀羅粉末，共5份，分別放入50 mL的回流瓶中，編號，再分別加入30 mL 75 %的乙醇，在60℃條件下分別回流提取0.5、1、1.5、2、2.5 h，濃縮，將上述濃縮液加水50 mL，加熱溶解并調pH為2～3，過濾，氨試液堿化，用氯仿提取3次，回收氯仿稀釋后，在249.80 nm處測其吸光度。

1.3.4.3提取劑乙醇濃度篩選

稱取2 g曼陀羅粉末，共5份，分別放入50 mL的回流瓶中，編號，再分別加入30 mL 45 %、55 %、65 %、75 %、85 %的乙醇，60℃條件下回流提取2 h，濃縮，將上述濃縮液加水50 mL，加熱溶解并調pH為2～3，過濾，氨試液堿化，用氯仿提取3次，回收氯仿稀釋后，在249.80 nm處測其吸光度。

1.3.4.4料液比篩選

稱取2 g曼陀羅粉末，共5份，分別放入50 mL的回流瓶中，編號，再分別加入75 %的乙醇10、20、30、40、50 mL，在60℃條件下回流提取2 h，濃縮，將上述濃縮液加水50 mL，加熱溶解并調pH為2～3，過濾，氨試液堿化，用氯仿提取3次，回收氯仿稀釋后，在249.80 nm處測其吸光度。

1.3.5正交試驗優化提取條件

為了優化提取工藝，根據提取過程中的影響因素，考慮乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度4個因素，在單因素試驗基礎上，選擇L9（34）進行正交試驗，正交試驗因素水平見表1。以總生物堿稀釋液的吸光度值為考察指標，確定最佳提取工藝條件。

表1　正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal array design

1.3.6.1對照品溶液的制備

精密稱取硫酸阿托品5 mg，加水溶解，制成每1 mL 含0.05 mg的標準品溶液。

1.3.6.1標準曲線的制備

精密吸取上述對照品混合溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于20 mL試管中，各加0.05%溴百里香酚藍溶液3.0 mL，加水補至10 mL，分別再加入10 mL氯仿溶液，振搖1min后，倒入分液漏斗中靜置1 h，分取氯仿層，以未加對照品的氯仿萃取液為空白，在249.8 nm處測吸光度，以生物堿含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，做標準曲線，得線性回歸方程為y=0.619 3x+ 0.060 5（R2=0.999 8）。

1.3.7總生物堿含量計算

2　結果與分析

2.1生物堿提取液鑒定結果

生物堿提取液鑒定結果見2。

用碘化鉍鉀、溴水、濃硫酸、鎂粉、1 %乙酸鎂甲醇、5 %α-萘酚乙醇溶液等試劑鑒定，反應現象如表2所示。根據顯色反應和沉淀反應可對提取液進行定性分析，反應現象表明提取液中含有生物堿。

表2　試管法鑒定結果Table 2 Identification results by test tube method

2.2最大吸收峰波長的確定結果

曼陀羅總生物堿的紫外吸收光譜見圖1。

圖1　曼陀羅總生物堿的紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectrum of Datura stramonium L.total alkaloid

由圖1可知，以乙醇溶液為對照試劑，曼陀羅提取液在紫外分光光度計上全波段掃描后，在245 nm～295 nm的波長范圍內出現波峰，且249.8 nm處吸光度值最大，295 nm～395 nm之間吸光度值較平穩，395 nm后吸光度值逐漸減小，因此，確定249.80 nm為生物堿提取液最大吸收峰波長。

2.3單因素試驗結果

2.3.1提取溫度對提取效果的影響

提取溫度對OD249.80nm的影響見圖2。

圖2　提取溫度對OD249.80nm的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on OD249.80nm

由圖2可知，當溫度在30℃～60℃之間時，曼陀羅總生物堿的提取效果隨溫度升高而逐步升高，60℃時提取效果達到最大。溫度超過60℃時，提取效果開始緩慢下降，可能因為溫度升高生物堿分解，降低了生物堿的提取效果。因此，本試驗選擇提取溫度60℃為宜。

2.3.2提取時間對提取效果的影響

提取時間對OD249.80nm的影響見圖3。

圖3　提取時間對OD249.80nm的影響Fig.3 Effect of extraction time on OD249.80nm

由圖3可知，當提取時間由0.5 h上升到1.0 h時，提取效果迅速增加，而提取時間由1.5 h上升到2.5 h時，隨著時間的變化，提取效果平穩增加，這說明在2 h內生物堿在固液之間的傳質達到了平衡，而且提取時間過長，乙醇揮發，雜質成分溶解也隨之增加。因此，本試驗選擇提取時間2 h為宜。

2.3.3提取劑乙醇濃度對提取效果的影響

提取劑乙醇濃度對OD249.80nm的影響見圖4。

圖4　提取劑乙醇濃度對OD249.80nm的影響Fig.4 Effect of alcohol concentration on OD249.80nm

由圖4可知，當提取劑乙醇濃度在45 %～75 %之間時，曼陀羅總生物堿的提取效果隨乙醇濃度的增加逐漸增大，當增加到75 %時提取效果達到最大，在85 %時反而下降。因此，本試驗選擇75 %乙醇為宜。

2.3.4料液比對提取效果的影響

料液比對OD249.80nm的影響見圖5。

由圖5可知，當料液比在1∶5（g/mL）～1∶15（g/mL）之間時，曼陀羅總生物堿的提取效果隨料液比的減小逐漸增大，料液比為1∶15（g/mL）時提取效果達到最大；此后提取效果隨料液比的減小而逐漸下降。因此，本試驗選擇料液比1∶15（g/mL）為宜。

圖5　料液比對OD249.80nm的影響Fig.5 Effect of material/liquid ratio on OD249.80nm

2.4正交試驗結果

2.4.1正交試驗結果分析

正交試驗設計及結果見表3，正交試驗方差分析結果見表4。

表3　L9（34）正交試驗設計及結果Table 3 L9（34）orthogonal array design and results

表4　方差分析結果Table 4 Results of variance analysis

由表3的K及R（極差）值分析可知，影響回流法提取曼陀羅提取效果的因素次序為A＞B＞D＞C，即提取溫度＞提取時間＞料液比＞提取劑乙醇濃度，最佳工藝組合為A2B2C2D2。由表4方差分析可知，其中提取溫度對曼陀羅總生物堿提取效果的影響是顯著的，而提取時間、提取劑乙醇濃度和料液比對曼陀羅總生物堿提取效果的影響均不顯著，說明提取溫度是主要的影響因素。因此，曼陀羅生物堿提取的最佳工藝條件為A2B2C2D2即溫度60℃、時間2 h、乙醇濃度75 %、料液比1∶15（g/mL）。

2.4.2正交試驗結果驗證

為了驗證上述結果的準確性，重復提取A2B2C2D2，得總生物堿的含量為0.477 %。結果表明試驗結果總生物堿含量明顯高于正交設計的9個試驗號。因此，證明優選出的最佳工藝合理可行，其選擇結果是可信的。

3　結論

本試驗采用回流法提取曼陀羅總生物堿，通過L9（34）正交試驗對曼陀羅總生物堿的最佳提取工藝條件進行了優化。結果表明，影響曼陀羅總生物堿提取效果各因素的主次順序為最佳提取工藝為：提取溫度＞提取時間＞料液比＞提取劑乙醇濃度；最佳提取條件為：提取溫度60℃、時間2 h、提取劑乙醇濃度75 %、料液比1∶15（g/mL）。

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Optimization of Extraction Technology of Datura stramonium L.Total Alkaloids

SHANG Tian-cui1，WEI Gang2，LIU Ying1
（1.Key Laboratory at Universities of Education Department of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Yili Normal University，Yining 835000，Xinjiang，China；2.The Professional Foundation Course，Xinjiang Yining Health School，Yining 835000，Xinjiang，China）

Abstract：The extraction process for Datura stramonium L.total alkaloids by the method of alcohol refluxing was optimized.Four process conditions including extraction temperature and time，alcohol concentrationand，solid/solvent ratio were investigated for their effect on the extraction efficiency of Datura stramonium L.total alkaloids and optimized using an L9（34）orthogonal array design.Results showed that the optimal extraction conditions were extraction temperature of 60℃，extraction time of 2 h，alcohol concentration 75 %，and solid/ solvent ratio of 1∶15（g/mL）.

Key words：Datura stramonium L.；total alkaloid；extraction

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.020

基金項目：伊犁師范學院/自治區教育廳普通高等學校重點實驗室項目（2013YSHXYB09）

作者簡介：尚天翠（1979—），女（漢），高級實驗師，碩士，主要從事植物與微生物資源開發研究。

收稿日期：2014-11-26