均勻設計優化荷葉半仿生提取工藝

鄭丹丹，劉麗娜，王京龍，王占一，鄧艷美

(棗莊學院生命科學學院，山東棗莊　277160)

?

均勻設計優化荷葉半仿生提取工藝

鄭丹丹，劉麗娜，王京龍*，王占一，鄧艷美

(棗莊學院生命科學學院，山東棗莊277160)

[摘要]采用均勻設計法優選荷葉半仿生提取的最佳工藝條件.本研究以荷葉主要有效成分總黃酮得率以及干浸膏得率為評價指標，對荷葉的半仿生提取工藝條件進行優選，考察三煎pH、提取總時間對荷葉總黃酮提取率的影響，采用分光光度法測定總黃酮的含量.通過優化實驗并結合生產實際，確定荷葉半仿生提取的最佳工藝為3煎pH依次為3.5、6.5、9.0，3煎時間依次為2.0 h、1.5 h、1.5 h，所得荷葉總黃酮的提取率為9.7%.本法操作簡便，提取率較高，為荷葉總黃酮提取工藝的改進提供了理論依據.

[關鍵詞]半仿生提取；總黃酮；干浸膏；均勻設計

0引言

荷葉(Nelumbinis Folium)，系睡蓮科蓮屬多年生草本植物蓮(Nelumbo nuciferra Gaertn.)的葉片.廣泛分布在長江、黃河和珠江等三大流域.荷葉具有清熱解暑、升發清陽、涼血止血的功效，可用于暑熱煩渴、暑濕泄瀉、便血便漏[1].荷葉中的主要藥效成分為黃酮類及生物堿類化合物[2-3].研究表明，黃酮類物質具有很高的生物活性，如抗氧化、抑菌、降血脂、減肥作用等[4].

常用的提取黃酮類化合物的方法有溶劑提取法[5-6]、機械化學法[7]、微波提取法[8]、超聲波提取法[9]、超臨界流體萃取法[10]、酶解法等.半仿生提取法(Semi-bionic Extraction Method，SBE)這一中藥提取新技術堅持“有成分論,不唯成分論,重在機體的藥效學反應”的基本原則,從生物藥劑學角度模擬口服藥物在胃腸道的轉運過程,為口服給藥制劑提供了一種新的提取方法[11].

目前半仿生提取法已成功應用于杜仲葉黃酮、葛根黃酮、苦參黃酮[12]、大黃[13]、連翹[14]、梔子[15]等的提取,筆者尚未見用此法提取荷葉黃酮的研究報道.本研究采用半仿生法提取荷葉黃酮，以總黃酮得率，干浸膏得率作為綜合評價指標，通過均勻設計法考察不同因素和水平對提取工藝的影響，以期篩選最優提取工藝，為進一步高效利用荷葉有限資源提供理論依據.

1儀器與材料

1.1儀器

UV-2000紫外-可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)；HH-S4數顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)；RE52CS-2旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D Ⅲ循環水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；FA1104電子分析天平(上海科學儀器有限公司)；DHG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司).

1.2材料

荷葉，購于山東省棗莊市市中區，產地浙江省，經棗莊學院王京龍老師鑒定為睡蓮科植物蓮(Nelumbo nuciferra Gaertn.)的干燥葉，蘆丁(批號100080-200306)購于中國藥品生物制品檢驗所，濃鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑均為分析純.

2方法與結果

2.1荷葉總黃酮半仿生提取方法

2.1.1荷葉的預處理

將荷葉用自來水洗凈后再用蒸餾水洗2次，置于80 ℃干燥箱中烘干，然后將烘干的荷葉剪成約0.5 cm2小片，干燥保存，備用.

2.1.2樣本液的制備

稱取荷葉25.0 g，共9份，按均勻設計U9(91×33)表(中國航天工業總公司第三研究院提供)，確定煎煮用水的pH值和煎煮總時間為考察因素.各因素水平分別為：第一煎水的pH值為2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00、5.50、6.00，第二煎水的pH值為6.50、7.00、7.50，第三煎水的pH值為8.00、8.50、9.00，煎煮總時間為2.00 h、3.50 h、5.00 h.具體實驗方案見表1.加入不同pH的水，然后常壓下加熱回流提取3次.三煎用水量依次為藥材量的10、8、8倍,第一煎溶劑的pH用HCl，第二、第三煎溶劑的pH用NaOH溶液調整；三煎溫度為水浴控溫98 ℃，三煎水的pH及提取時間按照表2規定，分別將3煎提取液經致密篩網過濾，真空抽濾，收集濾液，濾液經旋轉蒸發儀濃縮，合并，定容到250 mL，即得樣品溶液A1～9號(質量濃度為100 mg/mL).

表1　U9(91×33)試驗設計表

注：煎煮總時間列中，3煎時間分配為2.0 h(1.0 h、0.5 h、0.5 h)，3.5 h(1.5 h、1.0 h、1.0 h)，5.0 h(2.0 h、1.5 h、1.5 h).

2.2含量測定

2.2.1對照品溶液的配制

精密稱取蘆丁對照品10 mg，置50mL容量瓶中，以無水乙醇超聲溶解，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得.

2.2.2蘆丁標準曲線的繪制

精確量取2.2.1項下對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，各加水至6 mL,加5%亞硝酸鈉溶液1 mL,使混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉10 mL,再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應的試劑為空白，用紫外-可見分光光度計，在500 nm處分別測定上述系列濃度標準溶液的吸光度，以蘆丁質量濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線(如圖1所示)，并求得標準曲線的回歸方程及線性相關系數.

圖1　蘆丁標準曲線

線性回歸方程y=10.609x-0.0059，R2=0.9996，說明在蘆丁濃度為0.008～0.048 mg/mL的范圍內，蘆丁濃度與吸光度成線性關系，且線性關系非常好.

2.2.3精密度考察

精密量取2.2.1項下對照品溶液2.0 mL，按2.2.2項下方法，連續測定5次，計算得RSD為0.478%，結果表明該測定方法精密度良好.

2.2.4穩定性考察

精密量取2.2.1項下對照品溶液2.0 mL，按2.2.2項下方法，分別于0、2、4、6、8、12 h測定蘆丁含量，計算RSD為0.993%(n=6)，證明該測定法測定過程中樣品穩定性良好.

2.2.5重復性考察

稱取荷葉25.0 g，按2.1.2項下方法制備樣本液，精密量取2.0 mL，置25 mL量瓶中，照2.2.2項下操作，自“加水至6 mL”起，依法測定吸光度，計算6次平行測定結果的RSD值為1.281%，說明該含量測定方法的重復性良好.

2.2.6回收率考察

精密稱取荷葉25.0 g，與適量蘆丁對照品混合，按2.1.2項下方法，制備樣本液，按2.2.2項下方法測定，計算回收率，平均回收率為104.7%(n=6，RSD=1.33%)，回收率滿足含量測定的要求.

2.2.7總黃酮含量測定

精密吸取2.1.2項下的樣品液A1～9各1 mL，用蒸餾水定容至25 mL，得供試液B1～9(質量濃度4 mg/mL).為了減少偶然誤差，采用平行對照方法，分別精確吸取供試液B1～93、4、5 mL于25 mL容量瓶中，按照2.2.2項下方法進行顯色，用空白的NaNO2·A1(NO3)3·NaOH溶液調零[16]，在500 nm波長處測其吸光度，依照下式計算總黃酮得率，進而求出每組的總黃酮平均得率.

式中，CA/(mg/mL)為由吸光度值帶入蘆丁標準曲線方程計算所得的黃酮濃度；CB/(mg/mL)為供試液濃度；V/(mL)為移取的供試液的體積；

2.2.8干浸膏得率的測定

精密量取A1～A9號樣品液各20.0 mL，置干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘干至恒重，計算干浸膏得率[14].

2.3均勻設計數據處理

表2　各指標得率、標準化處理及綜合評判

2.4工藝條件的優選

將表3-2及表4-2中Y值用SPSS軟件進行回歸分析處理，得回歸方程：Y=2.546X2-9.555X1X1-4.842X3X3+0.537X4X4+13.103X1X3-4.784X1X4-17.275X2X4+20.958X3X4-162.276(X1、X2、X3分別為第一煎、第二煎、第三煎的pH，X4為提取總時間).回歸方程顯著性水平P<0.01，回歸方程變量間關系是極顯著的.相關系數r=0.9999，說明回歸方程擬合效果極好.再進行規劃求解，得到優化結果.優化結果為X1=3.5345，X2=6.5，X3=9，X4=5，預測值為43.3227.

2.5優化條件的驗證

按2.1項下優化的提取方法，2.2項下含量測定方法，2.3項下數據處理方法，做3份驗證性試驗，見表3.

表3　驗證試驗結果

結果表明,驗證試驗綜合評價值與優選結果Y值基本一致，表明優化條件可行，總黃酮得率均值為9.7%(n=3，RSD=0.5%).

3討論

荷葉作為常用中藥材，在減肥降脂方面一直有著獨特的作用.本實驗采用混合均勻設計法，以總黃酮、干浸膏得率為指標，對荷葉半仿生提取法(SBE法)的工藝條件進行了優化.

結合生產實際，確定荷葉的半仿生提取工藝條件為：3煎用水的pH依次為3.5、6.5、9.0；3煎時間依次為2 h、1.5 h、1.5 h.驗證試驗結果也表明，荷葉的總黃酮提取率達到9.7%(總黃酮質量/原藥材質量)，提取效率較高.

半仿生提取法是基于灰思維模式，模擬人體胃腸道環境，采用連續的酸、堿溶劑進行提取的一種新提取技術[11].在指標選取時，既重視單體成分，又兼顧有效部位和活性混合物，綜合評判，體現了中醫藥整體觀念.

按照半仿生提取法的“有成分論，不唯成分論，重在機體藥效學反應”基本研究思路，在后期的工作中，還要進一步將半仿生提取法(SBE)與普通水提取法(WE)、醇提取法(AE)進行提取效率的比較，并進行相關的藥效學實驗.

參考文獻

[1]朱蘭鎮,李偉.荷葉總生物堿提取物對高血脂大鼠調節血脂作用研究[J].黑龍江醫藥, 2010,23(3):363-364.

[2]中華人民共和國藥典委員會. 中國藥典一部[S].北京:化學工業出版社,2015:275.

[3]王建濤,杜麗敏,張洪林.荷葉和黃藤中的生物堿對大腸桿菌代謝作用的微量量熱法研究[J].棗莊學院學報,2006,23(5):47-51.

[4]陳曦,戚進. 荷葉中黃酮和生物堿的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志,2015,21(18):211-214.

[5]侯莉偉,楊鳳梅,楊明,等. Box-Behnken設計優化荷葉總黃酮的溫浸提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志, 2013, 19(18):51-54.

[6]徐燕燕,易陽,田春莊.荷葉總黃酮提取工藝優化及其抑菌活性評價[J].現代農業科技, 2015(21):289-292.

[7]高夢祥,郭珊珊.機械化學法提取荷葉總黃酮的工藝研究[J].湖北農業科學,2013,52(23):5825-5828.

[8]付洋,張良慧,江慎華,等.超聲-微波協同提取荷葉總黃酮工藝優化及其提取效果分析[J].食品工業科技, 2015, 36(18):261-266.

[9]李大海,李妍,許暉.比較超聲提取和雙水相萃取荷葉總黃酮的研究[J].廣州化工, 2014,42(16):59-61.

[10]湯芬,傅亞平,鄧放明.超臨界CO2流體萃取荷葉總黃酮的工藝優化[J].食品與機械, 2013,29(4):149-152.

[11]孫秀梅,張兆旺.建立中藥用“半仿生提取”研究的技術平臺[J].中成藥,2006,28(4):614-616.

[12]惠建國,孫秀梅,張兆旺. 苦參半仿生提取法與水提取法的比較[J].山東中醫藥大學學報, 2007,31(3):245-246;255.

[13]黃良永,孟斐,楊光義.均勻設計法優選大黃半仿生提取工藝[J].中國藥師, 2014,17(9):1499-1502.

[14]黃良永,孟斐,楊光義.均勻設計法優選連翹半仿生提取工藝[J].中國藥師,2014, 17(10):1633-1636.

[15]葉方,劉襄艷,楊光義,等.均勻設計法優選梔子半仿生提取工藝條件[J].中國藥師, 2015,18(1):46-48.

[16]尤靜,任曉芳,劉春葉,等.菊花中總黃酮成分不同提取工藝的比較[J].江蘇農業科學, 2014,42(5):218-219.

[責任編輯：閆昕]

Optimization of Semi-Bionic Extraction Process of Lotus Leaf by Uniform Design

ZHENG Dan-dan, LIU Li-na, WANG Jing-long*, WANG Zhan-yi, DENG Yan-mei

(College of Life Sciences, Zaozhuang University, Zaozhuang 277160, China)

Abstract:Uniform design was used to optimize semi-bionic extraction (SBE) process of Lotus leaf. The optimum process conditions of semi-bionic extraction of Lotus leaf were studied with total flavonoids and dried extract weight as the index. Besides, effects of the pH value and extraction time of the three-time extraction were investigated. Spectrophotography method was conducted to determine the content of total flavonoids. Combined with the industrial production practice, the optimal extraction process was as follows: pH value of water in the three-time extraction was 3.5, 6.5 and 9.0, with the extraction time of 2.0 h, 1.5 h and 1.5h, respectively. The obtained method was easy and simple to operate and the extract rate of total flavonoids was relatively high, which provided a theoretical basis for the extraction optimization of Lotus leaf.

Key words:semi-bionic extraction; total flavonoids; dried extraction; uniform design

[中圖分類號]O657.32

[文獻標識碼]A

[文章編號]1004-7077(2016)02-0092-05

[作者簡介]鄭丹丹(1989- )，女，山東棗莊人，棗莊學院生命科學學院助教，碩士研究生，主要從事中藥制劑新劑型與新技術的研究.王京龍(1988- )，男，山東濟南人，棗莊學院生命科學學院講師，博士研究生，主要從事中藥新藥研發與炮制原理的研究.

[收稿日期]2016-01-20