12個煙草品種抗TMV病綜合性評價

趙曉航，　金妍姬，　金春范，　馮　月，　王家川，　樸世領*

(1.延邊大學農學院，吉林 延吉 133002；2.延邊朝鮮族自治州農業科學院，吉林 龍井 133400；

3.圖們市月晴鎮農業技術推廣站，吉林 圖們 133100)

?

趙曉航1，金妍姬2，金春范3，馮月1，王家川1，樸世領1*

(1.延邊大學農學院，吉林 延吉 133002；2.延邊朝鮮族自治州農業科學院，吉林 龍井 133400；

3.圖們市月晴鎮農業技術推廣站，吉林 圖們 133100)

摘要：以12個煙草品種為試材，進行人工誘導接種TMV試驗，鑒定12個煙草品種抗性程度。結果表明：延曬六號、吉煙九號、CV91、SY03-1為免疫品種；建平大蘭花煙、延曬三號、延曬七號、小馬稀為中抗品種；延曬二號、大馬稀、延曬一號、云煙87為中感品種。并以接種TMV后18、36 d的抗氧化酶活性、干物質、光合效率和葉綠素含量等測定值為指標，利用隸屬函數法將抗性程度進行綜合性分析。結果表明：由強到弱依次為免疫品種、中抗品種和中感品種。其中，延曬六號的隸屬函數值最高，為0.995 2,抗性最強;大馬稀的最低，為0.046 9,抗性最弱。

關鍵詞：煙草；TMV；抗性鑒定；生理生化指標；綜合性評價

煙草是我國廣泛種植的重要經濟作物之一，也是我國重要的經濟來源。煙草花葉病毒是危害嚴重的侵染性病毒,已經成為危害我國煙草生產的主要病害。控制煙草花葉病毒最經濟有效的手段是選育和利用抗病品種。在逆境脅迫下，植物體內保護酶活性和MDA含量、葉綠素含量會發生相應變化，這些變化量目前已作為評價逆境傷害程度和植物適應性的指標而被廣泛應用[1]。本文通過這些指標的變化規律來鑒定不同煙草品種的抗病性，但由于抗病性是由一個多基因控制的復雜性狀，為了減少單一指標評價的片面性[2],本文對12個煙草品種進行了人工誘導接種TMV病鑒定，并且利用模糊數學中的隸屬函數法求取各指標的平均隸屬函數值,并對12個煙草品種進行綜合性排序。這不僅能較全面評價不同煙草品種的抗病性，還能對各品種的各項指標進行綜合分析，使評價的結果與實際更為接近[3]。隸屬函數值法雖然方法繁瑣,但結果較為可靠,可為今后抗病性資源的篩選和育種研究工作奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料及地點

試驗材料為延邊朝鮮族自治州農業科學院提供的12個煙草品種。試驗地點為延邊大學農學院溫室。

1.2試驗設計

待煙苗長至4～5片真葉時，選擇陽光充足的上午，將煙苗假植于26孔簡塑盤內(直徑8 cm，高7 cm)，對12個煙草品種進行人工誘導接種TMV試驗。每個品種接種1盤作為接種處理，一盤不接種病毒作為對照處理(CK)(表1)。

表1　試驗方案

1.3測定項目及方法

1.3.1人工誘導接種TMV病毒

延邊朝鮮族自治州農業科學院煙草研究所提供TMV病葉。將新鮮的TMV病葉加入少量滅菌后的磷酸緩沖液(1∶200)，并在研缽中研磨，用滅菌紗布濾去病葉殘體，取出新鮮汁液制成接種物。當煙苗長至4～5片真葉時，于陽光充足時進行TMV病毒接種。用滅菌棉簽蘸取TMV病毒汁液，并輕劃葉片進行病毒接種，接種后清水沖掉接種葉片上殘留的病毒汁液，溫室溫度保持在25～30 ℃，注意病蟲害侵襲。

1.3.2病情指數及抗性指數測定

病情指數劃分為5個等級：0級，全株無病；1級，心葉或輕微花葉,上部1/3葉片花葉但不變形,植株無明顯變化；2級，個別葉片出現花葉病，1/3～1/2葉片花葉或者主脈變黑；3級，1～2片煙葉較為嚴重，1/2～2/3葉片花葉,或主側脈壞死；4級，多數葉片為重花葉，嚴重變形壞死。

其中，DI為參試品種的病情指數，D0為感病對照品種的病情指數。

抗性指數等級劃分標準[6]：免疫(I),NL；抗病(R),≤-1.3 ；中抗(MR),-1.3～-0.8；中感(MS),-0.8～-0.2 ；感病(S),≥-0.2。

1.3.3抗氧化酶活性和MDA含量測定

在接種后第18、36天分別測定12個煙草品種接種和未接種處理的抗氧化酶活性和MDA含量。每個品種選取長勢一致的5個煙株，取3片真葉進行測定。取樣后用液氮罐保存并迅速送到實驗室進行處理，3次重復。

SOD活性測定采用氮藍四唑法；POD活性測定采用愈創木酚法；CAT活性測定采用紫外分光光度法；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法[7]。

1.3.4實際光合效率Y(II)及葉綠素含量測定

在接種后第18、36天分別測定12個煙草品種接種和未接種處理的實際光合效率Y(II)和葉綠素含量。Y(II)采用PAM-2500便攜式調制熒光儀測定，每個品種選取長勢一致的5個煙株，取3片真葉進行測定。葉綠素含量則采用SPAD-205葉綠素儀進行測定，每個品種選取長勢一致的5個煙株，取3片真葉進行測定。

1.3.5干物質積累

在接種后第18、36天分別測定12個煙草品種接種與未接種處理的干物質。

采用常壓干燥法[8]先將煙株去泥后測鮮重，再將整株煙株放入于DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱，100～105 ℃烘箱中連續烘干,直到3次恒重，得到煙株干重。

1.4數據分析

1.4.1接種與未接種處理生理指標的增減幅度

1.4.2隸屬函數綜合評價

隸屬函數綜合評價法采用模糊數學中隸屬函數計算公式進行定量轉換后，再將各指標隸屬函數值取平均，進行比較，平均值越大，抗性越強，反之則越小。隸屬函數公式為[9]：

式中，X(u)為隸屬函數值；X為各處理指標測定值；Xmin、Xmax為所有參與試驗處理中某一指標內的最小值和最大值。

如果某一指標與綜合評判結果為負相關，則用反隸屬函數進行定量轉換。計算公式為：

2結果與分析

2.112個煙草品種人工誘導接種TMV抗性鑒定

由12個煙草品種人工誘導接種鑒定結果(表2)可知，延曬六號、吉煙九號、CV91和SY03-1病情指數均為0，抗性指數均為NL，為TMV免疫品種。小馬稀、建平大蘭花煙、延曬三號、延曬七號病情指數范圍為25.1%～50.0%，抗性指數為-1.3～-0.8，為TMV中抗品種。云煙87、延曬一號、延曬二號、大馬稀病情指數范圍為50.1%～75.0%，抗性指數為-0.8～-0.2，為TMV中感品種。病情指數越大抗性越弱，排序由大到小依次為：大馬稀、延曬二號、云煙87、延曬一號、延曬七號、延曬三號、建平大蘭花煙、小馬稀和4個免疫品種(病情指數為0)。

表2　12個煙草品種人工接種鑒定結果

2.2接種TMV 18 d時，接種與未接種處理間生理生化測定值的變化幅度

由表3可知，接種TMV 18 d時，12個煙草品種接種與未接種處理間的生理指標存在一定的變化規律。在抗氧化酶活性、丙二醇含量上，接種處理均高于未接種處理，出現增幅趨勢。SOD、POD、CAT活性增幅由大到小依次為免疫品種、中抗品種、中感品種。SOD、CAT增幅最大的均為吉煙九號，分別為51.94%，51.84%。POD增幅最大的是延曬六號，為48.47%。SOD、POD增幅最小的均是大馬稀，分別為24.92%，14.71%。CAT增幅最小的是云煙87號，為34.53%。這說明SOD、POD、CAT活性增幅大的品種抗性越強，反之則弱。MDA含量增幅由大到小依次為中感品種、中抗品種、免疫品種。其中，增幅最大的是延曬一號，為55.484%。增幅最小的是延曬六號，為27.319%。說明MDA含量增幅小的品種抗性強，反之則弱。

表3　接種TMV 18 d，接種與未接種處理間生理生化指標測定值的變化幅度

TMV脅迫下，未接種處理與接種處理間的光合效率、葉綠素含量、干物質積累也存在差別，對照處理均高于接種處理，出現下降趨勢。光合效率、葉綠素含量、干物質積累下降幅度最大的是中感品種，其次是中抗品種，最后是免疫品種。其中，光合效率、葉綠素含量降低幅度小的均是吉煙九號，分別為-10.454%和-21.22%。干物質積累降低幅度最小的是延曬六號，為-10.52%。光合效率降低幅度最大的是延曬二號，為-37.689%。葉綠素含量、干物質降低幅度最大的均是大馬稀，分別為-28.25%，-34.52%。光合效率、葉綠素含量、干物質積累降低幅度越小抗性越強，降低幅度越大，TMV抗性越弱。

2.3接種TMV 36 d時，接種與未接種處理間生理生化指標測定值的變化幅度

由表4可知，隨著接種天數的增加，到接種36 d時，接種處理的抗氧化酶活性均低于未接種處理，與接種18 d時恰好相反，出現下降趨勢。抗氧化酶活性下降幅度由大到小依次為中感品種、中抗品種、免疫品種。接種36 d時，MDA含量、葉綠素含量、光合效率、干物質積累的變化規律與接種18 d時基本一致。即在丙二醇含量上，接種處理均高于未接種處理，出現增長趨勢，而在葉綠素含量、光合效率、干物質積累上 ，對照處理均高于接種處理，出現下降趨勢。

表4　接種TMV 36 d，接種與未接種處理間生理生化指標測定值的變化幅度

由表4可知，SOD、POD活性下降幅度最小的均是吉煙九號，分別為-3.07%和-20.22%。CAT下降幅度最小的是CV91，為-11.62%。SOD下降幅度最大的是延曬一號，為-22.00%。POD下降幅度最大的是大馬稀，為-43.46%。CAT下降幅度最大的是云煙87，為-33.75%。這說明SOD、POD活性降低幅度越小，TMV抗性越強，降低幅度越大，TMV抗性越弱。MDA含量增幅最大的是延曬二號，為29.545%，增幅最小的是SY03-1，為13.422%。光合效率降低幅度最大的是延曬一號，為-68.00%，降低幅度最小的是吉煙九號，為-48.335%。葉綠素含量降低幅度最大的是大馬稀，為-50.13%，降低幅度最小的是SY03-1，為-43.46%。干物質積累降低幅度最大的是云煙87，為-63.92%，降低幅度最小的是CV91，為-40.12%。

2.4接種TMV 18和36 d時，隸屬函數測定值及綜合排序

接種18和36 d時，接種與未接種處理生理生化指標的隸屬函數值見表5。采用模糊數學中隸屬函數計算公式，先將表3和4中生理生化指標測定值的變化幅度定量轉換為隸屬函數值，再將其隸屬函數值取平均進行比較，其值越大，抗性越強，反之則越小。

表5　接種TMV 18和36d時，生理生化指標隸屬函數測定值及綜合排序

由表5可知，排序靠前的是免疫品種，隸屬函數值為0.995 2～0.989 9，其次是中抗品種，隸屬函數值為0.432 7～0.428 6，最后是中感品種，隸屬函數值為0.067 1～0.046 9。12個煙草品種隸屬函數值最終排序由大到小依次為：延曬六號>SY03-1>CV91>吉煙九號>小馬稀>建平大蘭花煙>延曬七號>延曬三號>延曬二號>云煙87>延曬一號>大馬稀。延曬六號的隸屬函數值最高，為0.995 2，抗性最強。大馬稀的隸屬函數值最低，為0.046 9，抗性最弱。

3討論與結論

3.112個煙草品種人工接種TMV抗性鑒定

供試的12個煙草品種在接種TMV 10 d后，煙苗逐漸出現發病癥狀，接種21 d后，病害發展較為嚴重。此時對煙草品種進行病情指數調查的結果表明：延曬六號、吉煙九號、CV91、SY03-1，4份供試品種全株煙苗沒有發病癥狀，病情指數均為0，為TMV免疫品種；小馬稀、建平大蘭花煙、延曬三號、延曬七號，4份試驗材料發病癥狀比較明顯，葉片出現了花葉和斑駁的現象，病情指數均為25.1% ～50.0%，為TMV中抗品種；云煙87、延曬一號、延曬二號、大馬稀等4份試驗材料發病癥狀嚴重，葉片花葉嚴重，葉基松散，葉邊向外部卷曲，病情指數均為50.1%～75.0%，為TMV中感品種。

延曬六號、吉煙九號、CV91、SY03-1抗性指數NL，為TMV免疫品種；小馬稀、建平大蘭花煙、延曬三號、延曬七號抗性指數為-1.3～-0.8，為TMV中抗品種。云煙87、延曬一號、延曬二號、大馬稀抗性指數為-0.8～-0.2，為TMV中感品種；本試驗的抗TMV性鑒定結果與金愛蘭等人的研究結果基本一致[10]。

3.212個煙草品種生理生化指標抗病性鑒定

不同類型的保護酶相互作用共同維持著植物體的正常代謝，其活性強弱可以反映植物體生理活動的強弱，也可以作為判斷植物抗逆性強弱的指標[11]。植物抗氧化酶作為氧自由基的清除劑，在逆境脅迫情況下，其活性變化依植物品種抗逆能力不同而異[12]。本試驗結果表明,在抗氧化酶活性方面，在接種18 d時,接種處理均高于對照處理，出現增長趨勢，增幅大的是免疫品種，其次是中抗品種，增幅最小的是中感品種。這說明增長幅度大的品種抗性強。這與覃鵬、曾淑華等人的研究結果一致[13-14]。在接種36 d時,接種處理均低于對照處理，出現下降趨勢，降低幅度最小的是免疫品種，其次是中抗品種，最后是中感品種。說明衰減幅度小的品種抗TMV能力強。房保海等[15]研究表明,無論抗病品種還是感病品種經煙草低頭黑病菌處理后抗氧化酶活性均表現為先升高后下降,這點與本試驗結果相同。

MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，它的產生還能加劇膜的損傷。因此,在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一個常用指標，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，膜脂過氧化作用增加，使MDA含量上升。因此,可以通過MDA含量的增加幅度來判斷TMV的抗性程度。本試驗研究結果表明，在接種18和36 d時，接種處理MDA含量均高于對照，出現了增幅趨勢,并且中感品種>中抗品種>免疫品種，說明增幅小的品種抗性強。這與文才藝等的研究結果一致[16]。

干物質積累出現降幅趨勢，這是由于隨著感病程度的不斷加重，干物質的形成與積累明顯減少。下降幅度由大到小依次為中感品種，中抗品種和免疫品種。也就是說降低幅度小的品種抗性強,這與毛健民等的研究結果一致[17]。

葉片中葉綠素的含量是維持植物正常光合作用以及葉片色澤、顏色的主要指標[18]。屬于一類含脂的色素家族，參與了捕光色素復合體的形成，是進行光能轉化和碳水化合物形成必不可少的因素之一，在光合作用中起著重要作用[19]。葉綠素含量和光合效率在接種18和36 d時，未接種處理均低于對照處理，出現了降幅趨勢，降幅最大的是中感品種，其次中抗品種，最后免疫品種。造成這種現象的原因,主要與感病品種葉片的葉綠體被破壞和光合色素含量降低有直接關系。說明降低幅度越小,抗性越強，降低幅度大，抗性弱。這與郭興啟、彭晏輝等人的研究結果一致[20-21]。

3.312個煙草品種隸屬函數值綜合性排序

隸屬函數分析提供了一種在多指標測定基礎上對煙草抗病性進行綜合評價的途徑，避免了單一指標的片面性[22]。12個煙草品種隸屬函數綜合性排序結果表明，平均值越大，抗性越強，反之則弱。排序從大到小依次為免疫品種、中抗品種和感病品種。免疫品種隸屬函數值為0.995 2～0.989 9，中抗品種隸屬函數值為0.432 7～0.428 6，中感品種隸屬函數值為0.067 1～0.046 9。免疫品種抗TMV性由強到弱依次為延曬六號、SY03-1、CV91和吉煙九號，中抗品種由強到弱依次為小馬稀、建平大蘭花煙、延曬七號和延曬三號，中感品種由強到弱依次為延曬二號、云煙87、延曬一號和大馬稀。其中，延曬六號隸屬函數值最高，為0.9952，抗TMV性最強。大馬稀最低，為0.0469，抗TMV性最弱。本試驗結果表明,以病情指數、抗性指數為指標的直接評價法和多指標的隸屬函數綜合評價法鑒定結果一致，說明利用隸數函數綜合評價煙草的抗病性是可靠、易行的。

參考文獻：

[1]李新安,李廣領,謝蘭芬,等.氟磺胺草醚對后茬作物小麥生理指標的影響[J].河南科技學院學報,2015,43(5):36-39.

[2]許桂芳,張朝陽,向佐湘.利用隸屬函數法對4種珍珠菜屬植物的抗寒性綜合評價[J].西北林學院學報,2009,24(3):24-26.

[3]高克昌,韓云麗,趙隨堂,等.用隸屬函數對小扁豆品種進行綜合評價[J].雜糧作物,2007,27(1):22-24.

[4]Zhu X C，Shi J K.YC / T39 - 1996 Grade and investigating method of tobacco disease(in Chinese)[S].Beijing: State Tobacco Monopoly Bureau,1996.

[5]彭冠云.抗煙草花葉病毒物質篩選及作用機理初步研究[D].長沙:湖南農業大學,2006.

[6]黃婷.煙草品種對煙草花葉病毒病和黃瓜花葉病毒病的抗病性鑒定研究[D].楊凌:西北農林科技大學,2012.

[7]李合生.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京:高等教育出版社,2000:164-167,260.

[8]王小春，楊文鈺,鄧小燕,等.玉米大豆和玉米甘薯模式下玉米干物質積累與分配差異及氮肥的調控效應[J].植物營養與肥料學報,2015,21(1):47-57.

[9]沈麗.密度與鉀素互作對烤煙生理生化指標及內在品質的影響[D].延吉:延邊大學,2012.

[10]金愛蘭,金妍姬,樸世領,等.35份曬煙品種(系)對PVY和TMV病的抗性鑒定[J].延邊大學農學學報,2014,36(3):204-210.

[11]孟令遠,馬光恕.不同施氮量對衛矛保護酶活性及可溶性蛋白含量的影響[J]黑龍江八一農墾大學學報,2014,26(5):1-4.

[12]趙美榮,李永春,常怡慧,等.兩種抗旱性不同的小麥幼苗對干旱脅迫的生理響應[J]赤峰學院學報(自然科學版),2015,31(3):11-13.

[13]覃鵬,劉葉菊,劉飛虎,等.干旱處理對煙草葉片SOD和POD活性的影響[J]中國煙草科學,2005(2):28-30.

[14]曾淑華,劉飛虎.5 ℃低溫對轉SOD或POD基因煙草影響的研究[J].廣西植物,2006,26(5):488-491.

[15]房保海,張廣民,遲長鳳,等.煙草低頭黑病菌毒素對煙草丙二醛含量和某些防御酶的動態影響[J].植物病理學報,2004,34(1):27-31.

[16]文才藝,吳元華,李浩戈,等.接種PVYN后煙草葉片SOD活性和MDA含量變化研究[J].中國煙草科學,1999(1):12-14.

[17]毛健民,鄭愛珍,白巖,等.煙草葉片感染花葉病毒時的某些生理生化變化[J].吉林農業大學學報,2002,24(4):19-21.

[18]尹立輝.三種不同花色品種非洲紫羅蘭的耐陰性研究[J].長春大學學報,2014,12(24):1705—1707.

[19]王忠孝,魏金鵬,楊克軍.不同肥力和種植密度對黑龍江省中西部地區玉米光合特性及產量的影響[J].安徽農業科學,2014,42(8):2225-2250.

[20]郭興啟,溫孚江,朱漢城.煙草感染馬鈴薯Y 病毒(PVY)后光合作用的變化規律[J].浙江大學學報:農業與生命科學版,2000,26(1):75-78.

[21]彭晏輝,雷娟利,黃黎鋒,等.馬鈴薯Y病毒侵染對葉綠體超微結構、光合和熒光參數的影響[J].植物病理學報,2004,1(006):33-35.

[22]崔祿,張玉霞,蘇日古嘎,等.紫花苜蓿品種種子萌發期的耐鹽堿能力分析[J].內蒙古民族大學學報(自然科學版),2014,29(3):311-314.

12 comprehensive evaluation on TMV resistance of 12 tobacco varieties

(.*)

(1.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity，YanjiJilin133002，China；2.AcademyofAgriculturalSciencesofYanbian，LongjingJilin133400，China；3.YueQingZhenAgriculturalTechnologyExtensionStationofTumen，TumenJilin133100，China)

Abstract：In this study, the artificial inoculation of TMV on 12 tobacco varieties was conducted, and consequently identified their TMV resistances. The results showed that Yanshai6, Jiyan9, CV91 and SY03-1 expressed as immunity to TMV and Jianpingdalanhua, Yanshai3, Yanshai7 and Xiaomaxi expressed as mid-resistance to TMV, whereas Yanshai2, Damaxi, Yanshai1 and Yunyan87 were mid-susceptible to TMV. In addition, the resistance degree was comprehensively analyzed by the subordinate function method using the indexes of antioxidant enzyme activity, dry matter, photosynthetic efficiency and chlorophyII content determined at 18 days and 36 days after inoculated TMV on 12 tobacco varieties. The results showed that the order of resistances to TMV was immune varieties, mid-resistant varieties and mid-susceptible varieties. Among the varieties, Yanshai6 had the highest subordinate function value of 0.992 1, revealing the highest resistance, whereas Damaxi had the lowest subordinate function value of 0.1809, revealing the weakest resistance.

Key words:tobacco;TMV;resistance identification; physiological and biochemical indexes；comprehensive evaluation

中圖分類號：S572

文獻標識碼：A

文章編號：1004-7999(2016)01-0005-08

DOI:10.13478/j.cnki.jasyu.2016.01.002

作者簡介：趙曉航(1991—)，女，黑龍江哈爾濱人，在讀碩士，研究方向為煙草營養生理。樸世領為通信作者，E-mail：pslpjj@ybu.edu.cn

收稿日期：2016-03-05基金項目：吉林省教育廳重點項目(吉教科合字[2015]第2號)；吉林省科技廳項目(201205089)