小麥ent—柯巴基焦磷酸合酶基因TaCPS1的克隆與熒光定量分析

郭慶東 李全權 田秋菊　　錢艷麗　　許田 楊艷林 王洪剛 封德順

摘要：ent-柯巴基焦磷酸合酶（ent-copalyl diphosphate synthase， CPS）是植保素合成途徑中的關鍵酶。本研究利用mRNA差異顯示技術，從小偃麥異附加系種質SN6306中得到一個與抗白粉病相關的TaCPS1基因。該基因ORF長2 394 bp，編碼797個氨基酸。對其進行生物信息學分析表明，該序列推導的蛋白無信號肽，主要由親水性氨基酸組成，可能存在于細胞質中；其具有類異戊二烯合成酶超家族的保守結構域。熒光定量分析結果表明，SN6306中的TaCPS1基因在白粉病菌E09誘導處理72 h時，表達量上調了大約45倍，但感病親本煙農15（YN15）基本不受誘導。在茉莉酸甲酯誘導下，TaCPS1基因表達量升高將近15倍；在水楊酸誘導下，TaCPS1基因表達量升高將近 2.4倍。推測TaCPS1基因可能參與小麥抗白粉病機制中的水楊酸和茉莉酸激素調節(jié)途徑。

關鍵詞：小麥；ent-柯巴基焦磷酸合酶；TaCPS1；基因克隆；生物信息學分析；熒光定量PCR；白粉病抗性

中圖分類號：S512.101文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）07-0001-09

小麥白粉病由禾本科布氏白粉菌（Blumeriagraminis f. sp.tritici （Bgt））引起，該病菌是一種專性寄生的子囊菌，只能在活的寄主組織上生長發(fā)育，白粉病菌對濕度和溫度的適應范圍很廣，小麥從幼苗到成株均可被白粉病菌侵染[1]。20世紀60年代以來，由于小麥半矮稈品種的推廣、氮肥施用量的增大，白粉病的危害日趨嚴重，在世界主要麥區(qū)由次要病害上升為主要病害，也成為我國小麥安全生產的主要限制因子[2]。雖然化學農藥對小麥白粉病防治有一定的作用，但會造成環(huán)境污染。克隆、鑒定和應用在小麥抗白粉病中起重要作用的基因對小麥抗病育種及穩(wěn)定糧食生產具有重要意義。

ent-柯巴基焦磷酸合酶（ent-copalyl diphosphate synthase， CPS）是赤霉素生物合成途徑中的關鍵酶，也是植保素合成途徑中的一個關鍵酶，其催化牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranyl geranyl diphosphate， GGDP）環(huán)化成古巴基焦磷酸（ent-copalyl diphosphate， CDP）[3]。

赤霉素是高等植物體內非常重要的一種植物激素，調控著莖的伸長、花的分化、種子和果實的發(fā)育以及休眠等多個生理過程[4，5]。高等植物中赤霉素生物合成途徑已基本確定[6，7]，CPS是其合成途徑中的關鍵酶。CPS的活性主要取決于CPS基因的表達水平，該基因主要受植物生長發(fā)育的調控[8，9]。CPS 基因若完全突變，植物不能產生任何赤霉素，這將導致植物種子不能萌發(fā)、植株矮化和雄性不育等[10，11]。

植保素是植物受到生物或非生物因子侵襲時在體內合成并迅速積累的抗微生物活性的小分子化合物，在植物抗病過程中起著重要作用。目前已分離鑒定的植保素大致可分為以下幾種：黃（烷）酮類、類黃酮類、倍半萜類、吲哚類、雙苯類、香豆素類、萜類、環(huán)二酮類、內酯類、醌類、苯乙酮類、苯并呋喃類以及生物堿類等。其中萜類成分廣泛存在于植物、真菌等生物體中，既包括固醇、胡蘿卜素等初級代謝產物，又包括成千上萬結構各異的次級代謝產物。萜類合酶是萜類成分生物合成的關鍵酶，萜類成分結構的豐富性與萜類合酶家族成員的多樣性密不可分。自1992年開始有植物萜類合酶基因克隆的報道，迄今為止，已有超過200種植物萜類合酶基因的cDNA被克隆，包括煙草、薄荷、番茄、丹參等多種植物的單萜合酶、倍半萜合酶、二萜合酶[12～17]。牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP） 是植物中二萜化合物的共同前體物質，其首先通過不同的環(huán)化酶催化成環(huán)，然后進一步形成結構各異的二萜化合物[18]。柯巴基焦磷酸合酶（CPS）是植物三環(huán)二萜類化合物生物合成過程中的起始環(huán)化酶。

Otomo等[19]報道了CPS在水稻中的生物學功能，指出其是赤霉素和植保素生物合成分支點的關鍵酶之一，并發(fā)現OsCyc1（即OsCPS4）、OsCyc2（即OsCPS2）和OsCPS1等酶分別參與了momilactones A、B，oryzalexin S、oryzalexins A～F和phytocassanes A～E以及赤霉素的合成，并且前二者基因表達量受紫外線誘導上調，而OsCPS1的表達量不受紫外線的誘導。Prisic等[20]報道了水稻中包含兩種不同的CPS基因，分別編碼CPS1ent和CPS2ent兩種酶。這兩種酶有不同的代謝功能，CPS1ent通常參與赤霉素的生物合成，而CPS2ent參與植保素的生物合成，這與Otomo等[19]的報道相一致。Prisic等[20]同時指出OsCPS1ent與玉米中參與赤霉素合成的An1/ZmCPS1ent的相似性比與其Ⅱ類萜合成酶旁系同源物的相似性要高，這種生物合成過程中跨物種的保守性反映出從赤霉素初級生物合成過程衍生出的相關次級代謝的分化先于禾本科內部導致現代玉米和水稻產生的不同世系的早期分化。Toyomasu等[21]根據小麥表達序列標簽從小麥中擴增出了三個CPS基因（TaCPS1、TaCPS2和TaCPS3），并且利用大腸桿菌進行了原核表達，證明這三個基因編碼的蛋白具有ent-柯巴基焦磷酸合酶的活性。通過進化樹和表達分析認為TaCPS3負責參與赤霉素的生物合成，而TaCPS1和TaCPS2則有可能在功能上與水稻中的OsCPS2 和OsCPS4同源，參與植保素的生物合成[22]。在玉米CPS的研究中，Harris等[22]在2005年報道了玉米的CPS基因（An2）受鐮刀菌誘導，An2編碼的蛋白和玉米中參與赤霉素生物合成的An1編碼的蛋白有約60%的相似性，其催化產生的二萜中間產物可能參與了初級或者次級代謝。Schmelz等[23]指出An2基因轉錄量的積累先于植保素kauralexin區(qū)域化的大量產生，這也印證了An2在玉米抗病中的重要作用。Falara等[24]報道了在百瑞木中克隆到一個二萜合成酶基因，該酶催化copal-8-ol二磷酸的合成，和其他物種中的柯巴基二磷酸合酶有較高的相似性，且該酶的表達量受傷害誘導。Kurusu等[25]報道顯示水稻CPS4（OsCPS4/OsCyc1）和類內根-貝殼杉烯合酶4（OsKSL4/OsKS4）負責參與momilactones的生物合成，而CPS2（OsCPS2/OsCyc2）和類內根-貝殼杉烯合酶7（OsKSL7/OsDTC1）則負責參與phytocassanes的生物合成，這些酶都受TvX/EIX的誘導。Kurusu等[25]研究還發(fā)現OsCIPK（Calcineurin B-like protein-interacting proteinkinases）14/15可能參與TvX/EIX誘導的植保素生物合成的調節(jié)，因此鈣離子信號途徑很有可能參與到這一過程中。

前人的研究表明柯巴基焦磷酸合酶在水稻和玉米等作物中具有抗植物病害作用，但其是否具有抗小麥白粉病的作用尚未見報道。在前期的研究中，我們以本實驗室培育的高抗白粉病異附加系小麥種質SN6306與高感白粉病親本小麥品種煙農15為材料，利用未經侵染和經過白粉病菌E09 誘導處理12 h 的小麥SN6306葉片cDNA來挖掘小麥白粉病菌誘導的差異表達片段，發(fā)現其中編號為47969的contig在誘導后表達量明顯上調。本研究根據小麥測序數據庫（http：//wheat-urgi.versailles.inra.fr/）中的相似性比對，通過PCR 方法從SN6306的cDNA中克隆到一個TaCPS1基因，并對此序列進行生物信息學和基因表達分析，為進一步研究TaCPS1基因在小麥抗白粉病中的作用及在育種中的應用奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為小麥-中間偃麥草雙體異附加系SN6306與其親本小麥煙農15。其中SN6306高抗小麥白粉病菌生理小種E09，為高感白粉病小麥品種煙農15 （YN15）（Triticum aestivum L.， 2n=42）與小麥近緣屬中間偃麥草（Thinopyrum intermedium， 2n=42）的雜交后代，附加了一對來自中間偃麥草的染色體。煙農15由煙臺市農業(yè)科學研究院育成，高感白粉病菌生理小種E09。

挑選籽粒飽滿的小麥種子用10% NaClO消毒10 min，隨后用蒸餾水漂洗數次，蒸餾水中催芽1 d 后，移至蛭石與基質（1∶1）的混合培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為光照時間16 h，光照強度12 000 lx，25℃；黑暗時間8 h，18℃。白粉病菌為北方和黃淮麥區(qū)流行小種E09，通過高感白粉病小麥品種YN15 來進行傳代培養(yǎng)。接種方法為首先用干凈棉棒在長滿白粉病菌的YN15 葉片上進行涂抹，然后對長至一葉一心期的SN6306 進行葉片接種涂抹。

1.2RNA提取與反轉錄

按照全式金公司RNA 提取試劑盒操作說明進行總RNA 提取。所用材料為SN6306經白粉病菌E09誘導12 h的葉片。瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法檢測提取的總RNA 的質量與純度。以提取的3 μg 總RNA 作為模板，以Oligo-dT為引物，利用TransScriptFirst-Strand cDNA Synthesis Super Mix （全式金）試劑盒進行反轉錄。具體方法如下：將RT管置于冰上，用移液器添加3 μL提取的總RNA，2 μL濃度為10 μmol/L的dT-ACP1，加RNase-free 水補至9 μL，用移液器吸打混勻；80℃水浴3 min，冰上放置2 min，短暫離心后，再加入2×TS Reaction Mix 10 μL與TransScriptRT/RI Enzyme Mix 1 μL，使反應體系總體積為20 μL，輕輕混勻；混勻后于42℃孵育90 min，94℃加熱2 min，冰上放置2 min，輕輕混勻；最后向反應體系中添加DNase-free 水80 μL，使其稀釋到100 μL，反轉錄產物放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3TaCPS1基因的克隆

通過對前期mRNA差異顯示技術得到的數據進行分析，發(fā)現編號為47969的contig受小麥白粉病菌誘導后上調表達，將該片段在NCBI上進行BlastN，發(fā)現比對區(qū)段與TaCPS1（已注冊，注冊號為AB439588.1）的相似性為99%。

根據比對結果我們推測該基因為TaCPS1基因，并根據其序列設計特異引物對TaCPS1F：5′-ATGCAGGTGTTTAACGGTAACC-3′和TaCPS1R：5′-GTAGTAAGGGAGGTTTTTCTCCAAC-3′，以SN6306經白粉病菌侵染后的葉片cDNA為模板進行擴增。PCR 反應體系為：2×PCR mix 10 μL （百泰克），10 μmol/L 的引物TaCPS1F和TaCPS1R各0.5 μL，反轉錄產物cDNA 2 μL，剩余用ddH2O補至20 μL。PCR 反應程序采用Touch-Down PCR 程序，即95℃ 5 min 預變性后，首先10個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降一度（94℃ 40 s， 62～52℃ 40 s， 72℃ 2.5 min），后進行27 個普通循環(huán)（94℃ 40 s， 52℃ 40 s， 72℃ 2.5 min），最后72℃延伸10 min，10℃保存。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，按照TaKaRa的膠回收試劑盒說明回收擴增產物，將回收產物與pEASY-T1 （全式金）載體過夜連接，轉化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞。選取3 個獨立陽性克隆送公司測序（上海博尚），以保證結果的準確性。

1.4生物信息學分析

按照黃春麗等[26]的方法對TaCPS1基因序列和蛋白序列進行生物信息學分析：使用ORF finder軟件對TaCPS1基因序列的開放閱讀框進行分析；使用在線SignalP工具對編碼蛋白序列的信號肽有無進行分析；使用ExPASy的ProtScale對編碼蛋白的親疏水性進行分析；利用NCBI上的BlastP功能對其蛋白結構等進行預測與分析；使用軟件DNAMAN進行蛋白的多序列聯配分析；使用軟件MEGA5 進行系統(tǒng)進化樹分析。

1.5小麥白粉病菌誘導下TaCPS1基因的表達情況分析

1.5.1小麥葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成所用材料為SN6306與YN15幼苗未經侵染（0 h）與經白粉病菌E09誘導處理12、24、48、72 h的葉片，共計10個樣品。總RNA提取及cDNA第一鏈的合成方法同1.2。

1.5.2TaCPS1基因的熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析設計擴增引物47969F/R，47969F：5′-ACCGTTGCAGCTCT

GAAGAA-3′與47969R： 5′-AGGGGCTCACCTCTTCCATA-3′，使該引物擴增的目的片段跨一個內含子序列且引物在高度同源的TaCPS2與TaCPS3的cDNA中無匹配。選用小麥β-Actin基因作為內參基因，引物序列為β-Actin F：5′-CCGGCATTGTCCACATGAA-3′與β-Actin R：5′-CGGTTCAGCTTTTCCTTTTGG-3′。以SN6306與YN15各時間點第一條鏈cDNA為模板，對白粉病菌誘導下TaCPS1基因的表達特征進行分析。

按照SYBRPremix Ex TaqTM說明書進行操作，于CFX96TM Real-Time PCR Detection System擴增儀上進行擴增。qRT-PCR反應體系（反應液配制在冰上進行）：2×SYBR Premix Ex Taq（TliRNaseH Plus）10 μL，2.5 μmol/L PCR 47969F/R引物各2 μL，模板cDNA<100 ng，ddH2O補至20 μL。

qRT-PCR反應程序：95℃預變性90 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)；65℃至95℃，每次升高0.5℃，每溫度持續(xù)5 s，繪制熔解曲線。反應結束后確認qRT-PCR的擴增曲線和熔解曲線，按照Livak 2-ΔΔCT方法進行結果分析[27]。

1.6水楊酸和茉莉酸甲酯誘導后TaCPS1基因的表達情況分析

1.6.1葉片處理將事先配制好的SA（100 μmol/L）、JAMe（0.5 g/L）兩種激素溶液分別噴灑于SN6306葉片，分別采取0、12、24、36、48、60 h和72 h七個時間點的葉片，于液氮中速凍，隨后轉入-80℃冰箱中長久保存，備用。

1.6.2總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成將分別經SA和JAMe處理0、12、24、36、48、60 h和72 h的SN6306葉片共計14個樣品進行總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成（方法同1.2）。

1.6.3熒光定量分析以上述反轉錄得到的cDNA為模板，以47969F/R為引物進行qRT-PCR，方法同1.5.2。

2結果與分析

2.1TaCPS1基因的克隆

將在SN6306的差異表達cDNA中篩選到的編號為47969的contig在NCBI上進行比對，發(fā)現其和普通小麥TaCPS1的序列相似度達到99%。以SN6306 cDNA為模板，用特異引物TaCPS1F/R擴增目的基因，1%瓊脂糖凝膠分離擴增產物，電泳后顯示大小約2 500 bp的條帶（圖1），經測序得到長度為2 531 bp的TaCPS1序列。該序列的部分片段與前期獲得的編號為47969的contig完全相符。

2.2TaCPS1基因的cDNA和氨基酸序列分析

使用ORF finder軟件對TaCPS1基因序列的開放閱讀框進行分析，預測TaCPS1基因編碼區(qū)長度為2 394 bp，編碼含有797個氨基酸的蛋白（圖2）。在ExPASY網站上對TaCPS1蛋白進行分析，其分子量為90 200.4 D，理論pI為5.88。

2.3TaCPS1的生物信息學分析

使用SignalP 4.1對TaCPS1蛋白序列的信號肽進行預測分析，結果表明該蛋白無信號肽。使用ProtScale工具在線分析TaCPS1蛋白序列親疏水性，結果表明該蛋白的氨基酸殘基主要為親水性氨基酸，推測其可能存在于細胞質中。采用NCBI 的BlastP對TaCPS1的蛋白結構進行預測，發(fā)現其具有類異戊二烯合成酶超家族（Isoprenoid-Biosyn-C1 superfamily）的保守結構域（圖3）。

通過DNAMAN對TaCPS1基因編碼的蛋白與從NCBI查找到的18個其它物種的CPS蛋白進行多序列比對分析，結果表明TaCPS1和其它物種的CPS蛋白在氨基酸序列上具有很高的相似性（圖4）。用MEGA5.0對共計19個CPS蛋白進行進化樹分析，從系統(tǒng)進化樹可以看出TaCPS1與粗山羊草CPS蛋白遺傳距離最近，進化上同源（圖5）。

2.4TaCPS1基因在小麥白粉病菌誘導后的表達情況分析

為了驗證TaCPS1基因在響應小麥白粉病菌中的作用，對其在SN6306與YN15對照（0 h）以及白粉病菌誘導12、24、48、72 h共計10個樣品中的表達模式進行了qRT-PCR分析。結果表明，熒光定量的熔解曲線峰單一，判斷無雜帶；SN6306中的TaCPS1基因在白粉病菌誘導處理24 h后，表達量開始上升，到72 h時，其表達量上調了大約45倍，但YN15基本不受誘導（圖6）。由此推測，TaCPS1基因受小麥白粉病菌誘導上調，可能和SN6306抗小麥白粉病有關。

2.5TaCPS1基因在水楊酸和茉莉酸甲酯誘導后的表達情況分析

為了進一步探究TaCPS1基因可能參與的抗白粉病機制，利用水楊酸和茉莉酸甲酯兩種激素對SN6306分別進行誘導，并分別采取各時間點葉片，進行實時熒光定量分析。結果表明，在茉莉酸甲酯誘導下，與0 h相比，TaCPS1基因表達量呈現出先升高后降低再升高的趨勢，并在誘導60 h時達到最高值，是0 h的近15倍（圖7）；在水楊酸激素誘導下，與0 h相比，TaCPS1基因表達量先降低后升高，并在誘導60 h時達到最高值，是0 h的2.4倍（圖7）。這表明TaCPS1基因可能參與了水楊酸和茉莉酸激素調節(jié)途徑。

3討論與結論

已有文獻報道在多種植物中存在多個CPS基因[28]，如日本粳稻全基因組中存在4個CPS基因，其中OsCPS1與植物激素赤霉素合成相關，OsCPS2與非赤霉素類二萜的生物合成相關，OsCPSsyn與

圖7TaCPS1基因在受到茉莉酸甲酯（上）與水楊酸（下）誘導后的表達情況syn-半日花烷型的二萜合成相關[20]。這些二萜化合物中的植保素成分在某種程度上促進了植物對相關外源傷害如紫外傷害等產生抗性。前人對小麥CPS基因已做了很多研究，Toyomasu等[21]根據小麥表達序列標簽從小麥中擴增出了三個TaCPS基因（TaCPS1、TaCPS2和TaCPS3）；Wu等[29]在小麥中發(fā)現了TaCPS4與TaCPS5基因；Huang等[30]在小麥7A、7B和7D染色體中分別發(fā)現了一個TaCPS基因。但是關于TaCPS基因在小麥中的功能沒有太多研究，大部分研究僅說明TaCPS基因與植物激素赤霉素和非赤霉素類二萜的生物合成相關，對TaCPS基因在小麥抗白粉病方面的作用還沒有報道過。本研究中，TaCPS1基因受小麥白粉病誘導表達量上調，說明其與抗白粉病作用有關；TaCPS1基因被水楊酸和茉莉酸甲酯誘導表達量上調，推測TaCPS1基因參與了小麥抗白粉病反應的水楊酸和茉莉酸激素調節(jié)途徑；TaCPS1基因的表達量明顯上調發(fā)生在第60 h，推測TaCPS1基因可能位于抗白粉病反應的下游途徑，受水楊酸和茉莉酸激素調控。

本研究克隆到TaCPS1基因，并發(fā)現該基因可能與小麥白粉病抗性有關。下一步我們將針對該基因構建大麥花葉病毒誘導的基因沉默（BSMV-VIGS）載體，擬進一步通過基因沉默技術探討該基因的功能，為研究TaCPS1基因在小麥抗白粉病中的作用及在育種中的應用奠定基礎。

參考文獻：

[1]孫蘇陽，李海軍，王永軍，等. 小麥白粉病的發(fā)生因素及防治對策[J]. 安徽農學通報，2009，15（6）：101，157.

[2]張海泉. 小麥抗白粉病分子育種研究進展[J]. 中國生態(tài)農業(yè)學報，2008， 16（4）：1060-1066

[3]Xu M， Hillwig M L， Prisic S， et al. Functional identification of rice syn-copalyl diphosphate synthase and its role in initiating biosynthesis of diterpenoid phytoalexin/allelopathic natural products[J]. Plant Journal， 2004， 39（3）：309-318.

[4]Blázquez M A， Soowal L N， Lee I， et al. LEAFY expression and flower initiation in Arabidopsis[J]. Development， 1997， 124（19）：3835-3844.

[5]Carzoli F G， Michelotti V， Fambrini M， et al. Molecular cloning and organ-specific expression of two gibberellin 20-oxidase genes of Helianthus annuus[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2009， 27（2）：144-152.

[6]Hedden P， Phillips A L. Gibberellin metabolism： new insights revealed by the genes[J]. Trends in Plant Science， 2001， 5（12）：523-530.

[7]Hedden P. Gibberellin metabolism and its regulation[J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2008， 59（4）：225-251.

[8]Smith M W， Yamaguchi S， Ait-Ali T， et al. The first step of gibberellin biosynthesis in pumpkin is catalyzed by at least two copalyl diphosphate synthases encoded by differentially regulated genes[J]. Plant Physiology， 1999， 118（4）：1411-1419.

[9]Silverstone A L， Chang C， Krol E， et al. Developmental regulation of the gibberellin biosynthetic gene GA1 in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal， 1997， 12（1）：9-19.

[10]Koornneef M， Veen J H V D. Induction and analysis of gibberellin sensitive mutants in Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.[J]. Theoretical & Applied Genetics， 1980， 58（6）：257-263.

[11]Sun T P， Kamiya Y. The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis[J]. Plant Cell， 1994， 6（10）：1509-1518.

[12]Tholl D. Terpene synthases and the regulation， diversity and biological roles of terpene metabolism[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2006， 9（9）：297-304.

[13]Facchini P J， Chappell J. Gene family for an elicitor-induced sesquiterpene cyclase in tobacco[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1992， 89（22）：11088-11092.

[14]Colby S M， Alonso W R， Katahira E J， et al. 4S-limonene synthase from the oil glands of spearmint （Mentha spicata）. cDNA isolation， characterization， and bacterial expression of the catalytically active monoterpenecyclase[J]. Journal of Biological Chemistry， 1993， 268（31）：23016-23024.

[15]Colby S M， Crock J， Dowdle-Rizzo B， et al. Germacrene C synthase from Lycopersicon esculentum cv. VFNT cherry tomato： cDNA isolation， characterization， and bacterial expression of the multiple product sesquiterpenecyclase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1998， 95（5）：2216-2221.

[16]Gao W， Hillwig M L， Huang L Q， et al. A functional genomics approach to tanshinone biosynthesis provides stereochemical insights[J]. Organic Letters， 2009， 11（22）：5170-5173.

[17]Vasiliki F， Akhtar T A， Nguyen T T H， et al. The tomato terpene synthase gene family[J]. Plant Physiology， 2011， 157（2）：770-789.

[18]Trapp S C， Croteau R B. Genomic organization of plant terpene synthases and molecular evolutionary implications[J]. Genetics， 2001， 158（2）：811-832.

[19]Otomo K， Kenmoku H， Oikawa H， et al.Biological functions of ent-and syn-copalyl diphosphate synthases in rice： key enzymes for the branch point of gibberellin and phytoalexin biosynthesis[J]. The Plant Journal， 2004， 39（6）： 886-893.

[20]Prisic S， Xu M， Wilderman P R， et al. Rice contains two disparate ent-copalyl diphosphate synthases with distinct metabolic functions [J]. Plant Physiology， 2004，136（4）： 4228-4236.

[21]Toyomasu T，Kagahara T，Hirose Y，et al.Cloning and characterization of cDNAs encoding ent-copalyl diphosphate synthases in wheat： insight into the evolution of rice phytoalexin biosynthetic genes [J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry， 2009，73（3）：772-775.

[22]Harris L J， Saparno A， Johnston A， et al.The maize An2 gene is induced by Fusarium attack and encodes an ent-copalyl diphosphate synthase [J].Plant Molecular Biology， 2005， 59（6）：881-894.

[23]Schmelz E A， Kaplan F， Huffaker A， et al.Identity， regulation， and activity of inducible diterpenoid phytoalexins in maize[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2011，108（13）：5455-5460.

[24]Falara V， Pichersky E， Kanellis A K.A copal-8-ol diphosphate synthase from the angiosperm Cistus creticus subsp. creticus is a putative keyenzyme for the formation of pharmacologically active，oxygen-containing labdane-type diterpenes [J]. Plant Physiology， 2010， 154 （1）： 301-310.

[25]Kurusu T， Hamada J， Nokajima H， et al.Regulation of microbe-associated molecular pattern-induced hypersensitive cell death， phytoalexin production， and defense gene expression by calcineurin B-like protein-interacting protein kinases， OsCIPK14/15， in rice cultured cells [J].Plant Physiology， 2010，153（2）：678-692.

[26]黃春麗， 宋靜， 李全權，等. 小偃麥異附加系TaXTH基因的克隆與生物信息學分析 [J]. 山東農業(yè)科學， 2015， 47（7）：1-6.

[27]Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J]. Methods， 2001， 25（4）：402-408.

[28]Toyomasu T. Recent advances regarding diterpene cyclase genes in higher plants and fungi[J]. Bioscience Biotechnology & Biochemistry， 2008， 72（5）：1168-1175.

[29]Wu Y， Ke Z， Toyomasu T， et al. Functional characterization of wheat copalyl diphosphate synthases sheds light on the early evolution of labdane-related diterpenoid metabolism in the cereals[J]. Phytochemistry， 2012， 84（6）：40-46.

[30]Huang Y， Yang W， Zhong P， et al. The genes for gibberellin biosynthesis in wheat[J]. Functional & Integrative Genomics， 2011， 12（1）：199-206.