基于SYBR Green檢測小麥黃花葉病毒的兩步法qPCR

劉成 鈴木孝子 佐久間俊 宋健民 李豪圣 劉愛峰 曹新有 韓冉

摘要：小麥黃花葉病毒病是其常發病，常造成嚴重減產。為建立可用于定量檢測小麥黃花葉病毒（WYMV）拷貝數的qPCR方法，本研究對不同來源的WYMV小種序列進行比對分析，在序列保守區域設計引物11對，對其退火溫度進行優化，進而建立各引物的qPCR標準曲線。結果發現，11對引物的擴增效率在50.60%～116.04%之間，僅2對引物可用于后續研究，擴增效率分別為97.21%（WY-05和WY-06）和91.85%（WY-F2和WY-R2）。利用其中的WY-F2和WY-R2對高抗和高感WYMV的小麥品種進行分析，結果顯示，抗感小麥品種WYMV拷貝數差異極顯著。對抗感分離群體266個單株進行分析，發現該qPCR方法靈敏度顯著高于酶聯免疫吸附劑測定法，更適用于抗感雜交分離群體的表型鑒定，因而可以用于抗WYMV基因的遺傳定位與圖位克隆工作。

關鍵詞：小麥黃花葉病毒；兩步法qPCR；酶聯免疫吸附劑測定法

中圖分類號：S435.121.4+9文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）07-0118-07

小麥黃花葉病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）是一種由禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）介導才能侵染寄主的土傳病原微生物，最早在日本發現[1]，后在中國和加拿大等國發現[2，3]。感病小麥表現為根系發育差、植株松散[2]、葉片發黃、生長發育遲緩甚至矮化[2，4]，分蘗力、成穗率和產量降低[2，5]，對小麥品質也有不利影響[6]。我國小麥黃花葉病毒病分布范圍廣，包括北部冬麥區的膠東沿海副區、黃淮冬麥區大部、長江中下游麥區和西南麥區部分地區等[7]，該病害受寄主感病程度、病毒毒力以及氣候因子特別是溫度影響較大[5]。近10年來，我國小麥黃花葉病毒病呈逐年加重之勢[2]，僅2006年，就有9個省爆發該病，受災面積達到200萬公頃，造成小麥減產15億千克[8]。

WYMV及其載體在土壤中的潛伏期很長。研究顯示，有WYMV發病土地，即使10年不種植小麥，10年后仍然對小麥具有較強的致病毒力[9]。所以，一旦某一麥區暴發該病將很難根除，對小麥生產威脅較大。因此，研究清楚抗小麥黃花葉病毒病品種的抗病機制對小麥分子育種具有重要意義，定位并圖位克隆抗WYMV基因進而進行基因功能驗證是研究抗WYMV機制的基礎。基于此，我們開展了抗WYMV基因的精細定位與圖位克隆工作（待發表）。而精確鑒定分離群體抗病性則為能否成功精細定位并圖位克隆到基因的關鍵，因此，材料抗病性鑒定方法就成為問題的重要一環。目前，對WYMV的鑒定方法有形態學調查[10]、蛋白水平檢測[11，12]和分子水平檢測[8，13]等。然而，上述方法均是檢測WYMV的定性分析方法，不能定量獲得植株感染病毒拷貝數進而對植株抗病程度進行精確界定。為了解決這一問題，本研究擬通過建立一種基于SYBR Green檢測WYMV的兩步法實時定量PCR（qPCR），并對抗感分離群體進行病毒拷貝數定量分析，確認可應用于WYMV病毒數鑒定的方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

高抗WYMV的美國小麥品種Madsen由日本國家研究中心提供。日本小麥品種（系）Hokushin（感WYMV）、TK-2（抗WYMV）和Shinchunaga（未鑒定WYMV抗性）由日本北海道中央農業試驗站提供，其中TK-2是Hokushin/Madsen的BC5F4近等基因系。編號為#001～#266的植株為Hokushin/TK-2的F2抗感WYMV分離群體。除Shinchunaga外，其余試驗材料全部種植于富含WYMV的日本北海道中央試驗農場編號為Minami-Mareppu 40的區域地塊里，當年秋季播種，次年4月中旬待植株充分發病后取樣進行病毒數檢測。所有參試材料均測定來自同一地塊不同位點的三個不同單株（取旗葉下的第二葉）的病毒拷貝數，減少因種植過于集中且土壤含病毒不均勻或病毒感染上傳不充分造成的誤差。除此之外，Madsen、Hokushin和Shinchunaga還被種植于日本國立農業生物資源研究所（筑波）不含WYMV的試驗農場中，作為前述種植于含WYMV地塊中樣品的陰性對照。

DNA酶Ⅰ購自TaKaRa公司，RNA純化及反轉錄所用試劑耗材、連接載體均購自Invitrogen公司。 qPCR所需試劑購自日本東洋紡公司，48孔反應板及高透光封口膜購自ABI公司。 滅菌DEPC移液槍頭和RNase AWAY分別購自QSP和MBP公司，ELASI試劑盒購自WAKO公司。

1.2試驗方法

1.2.1總RNA提取、檢測與純化取200 mg 鮮葉片放于加入氧化鋯珠的2 mL 離心管中，利用Retsch MM300混合型碾磨儀在25 Hz下震蕩1.5 min；加入Trizol 500 μL，室溫放置5 min；接著加入氯仿100 μL，室溫放置3 min，4℃、10 000×g條件下離心15 min；轉移上清液到另一新離心管中，加入異丙醇300 μL輕輕混勻，室溫放置10 min，4℃、10 000×g條件下離心10 min；棄上清，加入預冷的75%乙醇清洗，4℃、7 000×g條件下離心5 min，重復兩次；待RNA干燥后加入50 μL DEPC水溶解后保存于-20℃冰箱備用。

RNA的完整性在瓊脂糖凝膠中檢測，完整性較好的RNA濃度檢測在Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度計下進行。RNA中DNA污染的去除：50 μL的總反應體系包含50 μg總RNA、10 U的DNA酶Ⅰ、20 U的RNA酶抑制劑和DEPC水，輕輕混勻，37℃條件下處理2 h；處理完畢后，加入3 mol/L醋酸鈉（pH=5.2） 5 μL，輕輕混勻后加入異丙醇56 μL，混勻后在4℃、10 000×g條件下離心10 min；棄上清，用預冷的75%乙醇清洗，4℃、7 000×g條件下離心5 min，重復兩次；待RNA干燥后加入50 μL DEPC水溶解。

1.2.2高質量RNA的選擇與反轉錄純化后的RNA再次利用瓊脂糖凝膠檢測其完整性，完整性較好的RNA濃度再次利用Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度計進行檢測。分光光度計下A260/A280值在1.9～2.1范圍內且A260/A230值在2.0～2.4范圍內的用于后續反轉錄試驗。

反轉錄體系：包含總RNA 1 μg、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、Oligo（dT）12～18引物0.5 μL，DEPC水補至10 μL，65℃條件下處理5 min，迅速置于冰上；隨后，加入5×第一鏈緩合成緩沖液4 μL、0.1 mol/L二硫蘇糖醇（DTT） 1 μL、20 U的RNA酶抑制劑和25 U的SuperScriptTMⅢ 反轉錄酶，最后用DEPC水補足到20 μL后輕輕混勻。反應條件：25℃反應5 min，然后，50℃反應3 h，緊接著70℃反應15 min。反應完成后離心機瞬時離心，加入DEPC水80 μL，輕輕混勻使得cDNA終濃度為10 ng/μL，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.3序列比對與引物設計對NCBI數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中注冊的多條WYMV序列進行比對，在序列保守區域進行引物設計。序列比對在軟件DNAMAN上進行，引物設計利用在線軟件Primer 3（http：//frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）進行。根據序列比對結果共設計7條引物，包含左引物3條（WY-05、WY-F1和WY-F2），右引物4條（WY-R1、WY-R2、WY-06和WY-16），序列分別如下：WY-05： 5′-ACCAATGCCGCCACCAAAG-3′；WY-F1： 5′-TCGAACACGACAACTCCATC-3′；WY-F2： 5′-CCGTCAACGCAGGACTAAA-3′； WY-R1： 5′-CAGAGCGATGGAGTTGTCG-3′；WY-R2： 5′-TGGTGATGCCAAGACTGGT-3′；WY-06： 5′-GCATGGTCTGGCTTTCTGC-3′；WY-16： 5′-GCCCATTTTGTGACAATCTTGTG-3′。上述左引物和右引物分別組合（表1），用于qPCR最適引物篩選；其中WY-05和WY-16還用于小麥黃花葉病毒序列克隆。用作內參的Actin基因特異引物DN182500F425和DN182500R533的序列參照文獻[14]，所有WYMV拷貝數均用相應Actin拷貝數進行標準化。

1.2.4qPCR標準曲線建立將克隆的WYMV序列與內參Actin基因序列分別連接到pCR4-TOPO載體上，分別用引物WY-05和WY-16、DN182500F425和DN182500R533進行陽性克隆的篩選。陽性克隆在含氨芐青霉素的LB液體培養基里培養，提取質粒。利用上述序列克隆引物對獲得質粒進行測序，確認連接序列的正確性。將含WYMV序列與內參Actin基因序列的質粒DNA從107拷貝等比稀釋到10個拷貝（共7個濃度梯度），用于計算每對引物的擴增效率及后續絕對定量分析。樣品設置3個生物學重復及2個技術重復，平均log拷貝數及對應Ct值用于標準曲線的建立。

1.2.5qPCR反應與酶聯免疫吸附劑測定qPCR總體積為20 μL，包括TBSYBR混合液10 μL，3 mmol/L左右引物各2 μL，10 ng/μL cDNA 2 μL，參考染料0.4 μL，滅菌雙蒸水3.6 μL。反應程序為95℃ 1 min；主反應為35個循環，95℃ 15 s，60～65℃ 45 s（依據引物反應的優化溫度）；最后熔解曲線建立為1個循環，95℃ 15 s，55～65℃ 45 s（依據引物），95℃ 15 s。酶聯免疫吸附劑測定法（ELISA）參照文獻[11]。

1.2.6小麥黃花葉病毒數絕對量計算按照如下步驟計算：（1）質粒DNA的長度為空質粒3 956 bp（未連接小麥黃花葉病毒序列）+本研究所用小麥黃花葉病毒序列長度440 bp=4 396 bp；（2）質粒DNA分子量=質粒DNA長度（bp）×堿基平均分子量330道爾頓（D）×2（堿基/bp）=2 901 360 D（D=g/mol）；（3）1個拷貝的DNA重量=質粒DNA分子量（g/mol）÷（6.023×1023分子/mol）（阿佛加德羅常數）=481 713×10-23g/分子≈4.82×10-18 g/分子；（4）1 ng RNA中含病毒拷貝數=1 ng÷1個拷貝DNA重量（g/分子）=2.07×108分子（拷貝）/ng RNA。利用log（拷貝數/ng RNA）數值與ELISA數值進行方法學比較分析。

2結果與分析

2.1qPCR引物的選擇及標準曲線的建立

設計的qPCR引物在克隆的440 bp WYMV序列上的位置如圖1所示。左引物和右引物分別組合，獲得11個引物對（表1），用于qPCR最適引物的選擇。各引物對進行最適退火溫度優化，最適溫度的確定用擴增產物熔解曲線結果判定，其中引物對WY-F2和WY-R2、WY-05和WY-06在60℃、63℃和65℃條件下的產物熔解曲線如圖2所示。兩對引物在60℃和63℃條件下產物不單一或出現雙峰（圖2A、B、D和E），而65℃條件下兩引物對產物熔解曲線峰值單一（圖2 C和F），因此，該兩對引物的最適退火溫度均為65℃。各引物對的擴增片段長度、PCR效率和退火溫度等信息如表1所示。

利用合成的11對引物在其最適退火溫度下分別建立標準曲線。通過對qPCR決定系數和引物PCR效率等指標進行分析，結果顯示，所有引物對的qPCR決定系數均在0.99以上（表1），但僅引物對WY-05和WY-06、WY-F2和WY-R2的擴增效率（97.21%和91.85%）在可接受范圍90%～110%之內，可用于后續qPCR試驗。二者對應計算公式分別為y=-3.3782x+41.081和y=-3.3933x+38.580，其中，y為Ct值，而x為log拷貝數。利用內參基因特異引物DN182500F425和DN182500R533建立標準曲線（引物間序列長度為130 bp），獲得計算公式為y=-3.2379x+40.159。

2.2原始親本的qPCR檢測

對種植于含WYMV地塊的Madsen和Hokushin，種植于未感染WYMV地塊的Madsen、Hokushin和Shinchunaga的葉片、莖稈、根和麥穗分別提取RNA，反轉錄成cDNA。用擴增片段較短的WY-F2和WY-R2（相對于引物對WY05和WY06）對上述樣品以及絕對陰性對照ddH2O進行qPCR分析，結果發現，種植于含WYMV地塊的Hokushin含病毒數高達幾十萬個拷貝/ng RNA（log拷貝數值在5～6之間，圖3），而種植于不含WYMV地塊的Madsen、Hokushin和Shinchunaga各器官以及ddH2O含病毒數均為10個左右（log拷貝數值約為1，圖3，Madsen和Hokushin結果未列出），因此，種植于不含WYMV的植株以及種植于含WYMV地塊Madsen中的病毒數是由于試驗背景造成的。種植于含WYMV地塊的Madsen和Hokushin病毒數量差異極顯著，種植于不含WYMV地塊的植株病毒數一致極低，說明以WY-F2和WY-R2為引物進行的兩步法qPCR結果是準確可信的。

2.3抗感分離群體的qPCR和ELISA檢測

利用WY-F2和WY-R2對Hokushin/TK-2的F2抗感WYMV分離群體共266個單株進行qPCR分析，結果顯示，log（拷貝數/ng RNA）值在0～1（區間最大值的植株數包含在下一區間，下同）區間的有29株；在1～2區間的植株數最多，為186株；在2～3區間的有8株；在3～4區間的有15株；在4～5區間的有28株（圖4A）。原始雜交親本Madsen和Hokushin的log（拷貝數/ng RNA）值分別在0～1和5～6區間，即Hokushin/TK-2的F2單株的log（拷貝數/ng RNA）值均在兩原始親本log（拷貝數/ng RNA）范圍內。

利用ELISA對該群體進行分析，結果發現，ELISA值在0～0.5的植株最多，為220株；在0.5～1.0區間的僅有1株；在1.0～1.5區間的有3株；在1.5～2.0區間的僅有1株；未檢測到ELISA值在2.0～2.5區間的植株；ELISA值在2.5～3.0區間的有4株；在3.0～3.5區間的有37株（圖4B）。原始雜交親本Madsen和Hokushin的ELISA值分別在0～0.5和3.0～3.5之間，因此，Hokushin/TK-2的F2單株的ELISA值也均在兩原始親本ELISA值范圍內。

為了清晰地比較兩種方法，筆者對266個單株中編號為#228～#266植株以及原始雜交親本Madsen和Hokushin的log（拷貝數/ng RNA）值和ELISA值進行散點分析，結果發現，ELISA可以把供試植株分為ELISA值小于1（本研究中定義為抗病）和大于1.5（感病）兩類；qPCR也可以把供試植株分為log（拷貝數/ng RNA）值小于2.5（抗病）和大于3.5（感病）兩類（圖5A）。兩種方法均能把供試材料分成抗病和感病兩類，但是，編號為#243、#262和#266植株的ELISA值均低于1（圖5B），被認定為抗WYMV，但是三者的log（拷貝數/ng RNA）值卻高于3.5（圖5A、C），屬于感病類型，這表明本研究建立的兩步法qPCR較ELISA靈敏度高。

3討論與結論

迄今，檢測或鑒定WYMV的方法有肉眼鑒定法[10]、酶聯免疫吸附劑測定法[11]、反轉錄聚合酶鏈式反應法[8]、蛋白免疫印跡法[12]和環介導等溫擴增技術[13]，但是，這些方法僅能獲得植株是否感染WYMV信息，不能對植株感染病毒拷貝數進行精確鑒定。qPCR因為具有操作簡單、檢測方便和可以定量分析等優勢，已經在植物研究中得到廣泛應用[15]。Liu等[16]建立了依據TaqMan檢測小麥WYMV的一步法RT-qPCR，該方法對鑒定小麥WYMV拷貝數非常有效，然而，其價格相對于SYBR Green qPCR成本高3～5倍，且一步法RT-qPCR是將反轉錄和qPCR一次性完成，一旦試驗結果出現問題，將無法返回檢測。完成小麥抗病基因的圖位克隆往往需要篩選幾千甚至是上萬個單株才能實現獲得所需重組體[17，18]，因此，成本問題往往是需要考慮在內的。本研究建立的基于SYBR Green的兩步法qPCR能夠彌補上述一步法的不足之處，對大群體或較多樣本WYMV拷貝數鑒定可以優先選用。

因為WYMV需通過真菌感染小麥根部，進而向上進行轉運復制，最終在小麥葉片上表現出來[19]，兩步法qPCR在種植于無WYMV土壤中的Houkushin 的根部、莖稈、葉片、麥穗和絕對陰性對照ddH2O中均檢測到10個拷貝的WYMV，說明這10個拷貝是試驗背景造成的，該背景的無法消除性說明該方法在材料絕對拷貝數的檢測進而研究抗WYMV機理方面可能具有一定局限性。然而，10個拷貝的背景相對于感病植株幾十萬個WYMV拷貝差異極其顯著，因而，完全可以應用于抗感分離群體的表型鑒定。

qPCR能夠檢測到ELISA無法檢測到的感病植株，表明前者在對植株表型鑒定上具有明顯優勢。之前，Takeuchi等利用ELISA對Hokushin/Madsen重組自交系進行研究，認為來自Madsen的WYMV抗性可能受1個單顯性核基因控制[11]。近期，該課題組對這一結論進行了修正，認為來自Madsen的WYMV抗性受來自2DL和3BS染色體上的兩個主效QTL控制[20]。本研究利用qPCR對Hokushin/TK-2的F2 266個分離群體單株進行檢測，結果發現，這些F2單株的log（拷貝數/ng RNA）值不是完全正態分布的，而是分布于0～5的每個區間，說明該群體的WYMV抗性是一個數量性狀，而不是由單個基因控制的，與文獻[20]的研究結果相互印證。雖然文獻[20]依據ELISA對小麥表型鑒定的研究結論與本研究兩步法qPCR結果類似，但是依據本研究中兩種方法的比較結果，在條件允許的情況下，應優先推薦使用兩步法qPCR。該方法不僅可以應用于遺傳群體的抗WYMV表型鑒定，還有望被應用于抗WYMV小麥品種或種質的鑒定工作。

致謝：感謝日本國立農業生物資源研究所李超博士后、默罕默德博士后、王寧博士后和寧順宗博士的有益討論及小山晴美女士的技術支持。

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