卷煙清除自由基的天然添加劑的篩選及其效果評價

田恒　屠夢琪

摘要：研究了用于卷煙濾嘴的天然抗氧化劑活性的評價方法，同時驗證了多酚類、黃酮類等天然抗氧化劑去除自由基的能力。研究結果表明：確定的適合于在實驗室進行的對抗氧化劑的評價方法：HPLC法，考慮抗氧化劑的性能。分析得到的適于直接添加到卷煙濾嘴中的天然抗氧化劑：TP98%、TP35%、SIF40%、SIF20%、GSH。這5種抗氧化劑在去除穩定的自由基DPPH時都有較好的效果。以水：油=93：7（質量比）的比例添加天然抗氧化劑，對油劑的乳化沒有影響。對樣品水溶液分析了溫度對其去除率的影響。

關鍵詞：天然抗氧化劑；DPPH；HPLC；自由基

中圖分類號：Q562 文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2016）06-0190-04

1 課題主要任務和目標

研究目標為研究評價天然植物提取物抗氧化性的方法；根據評價結果篩選出合適的天然植物提取物抗氧化劑。

研究內容為查找文獻總結出抗氧化劑的評價方法，并從中選擇出適用于在實驗室進行實驗的方法；抗氧化劑的評價方法主要有：DPPH自由基清除法、FRAP法、β-胡蘿卜索-亞油酸乳化液氧化法、硫代巴比妥酸反應物（TBARS）值法等多種方法，綜合考慮這幾種方法，選擇出適于在實驗室進行實驗的方法。用所選的方法對茶黃素20%、茶多酚98%、茶多酚80%、茶多酚35%、大豆異黃酮40%、大豆異黃酮20%、紅茶40%、番茄紅索10%等抗氧化劑進行綜合評價。觀察抗氧化劑在油劑中的穩定性，評價溫度對抗氧化劑活性的影響。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

主要儀器選用自動進樣高效液相色譜儀1100型，美國Agileht公司；電子天平，上海精密科學儀器有限公司。

主要試劑選用無水乙醇（分析純）；甲醇（分析純）；茶黃素TF20%；茶多酚TP98%；茶多酚TP80%；茶多酚TP35%；大豆異黃酮SIF40%；大豆異黃酮SIF20%；紅茶BTE40%；番茄紅素LYC10%；谷胱甘肽GSH；ST-90油劑，南通醋酸纖維有限公司提供。

2.2 測定方法

DPPH自由基清除法是使用較廣泛的一種抗氧化劑的評價方法，由于清除劑直接作用于DPPH·自由基，反應時間僅需20min左右，操作簡單，且用一般的分光光度計即可測定，因此DPPH·法直接、靈敏、快速、簡便。而其他3種方法如：FRAP法、β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液氧化法、硫代巴比妥酸反應物（TBARS）值法，也可用于評價抗氧化劑的效果，但是FRAP法一般用于非酶抗氧化劑，而且其TPTZ工作液的制備和反應溫度要求較高；β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液氧化法其實驗過程比較復雜，β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液的制備過程也很復雜；硫代巴比妥酸反應物（TBARS）值法，需要放入生物培養箱中，40±1℃下培養，96h后取出再經過一系列處理才可進行評價，所需時間較長。綜合考慮以上4種方法，得出在實驗室中進行的最適方法為：DPPH自由基清除法。

選取了現在市場上較主流的天然植物抗氧化劑包括綠茶提取物（茶多酚TP98、TP80和TP35）和紅茶提取物（茶黃素）、大豆異黃酮、番茄紅素以及本實驗室通過微生物發酵提取得到的谷胱甘肽為比較對象，以1，1-聯苯-β-苦基偕腙肼（DPPH）為標準自由基，通過分光光度法和HPLC方法評價各類天然抗氧化劑體外清除自由基的能力，對其作為卷煙去自由基添加劑作初步的篩選。

2.2.1 HPLC法

用DPPH比色法評價抗氧化劑的自由基清除能力具有一些不足之處，比如無法正確評價某些藥物的抗氧化性，因為易受樣品中一些色素的干擾。現在發展出一種簡單、靈敏的HPLC化驗方法用于評價草藥的抗氧化能力。這種HPLC方法專用于DPPH，具有重復性好，可避免各種物質的吸光度的疊加，檢測時間短的優點，適合于快速檢測多個樣品的自由基清除能力。

（1）HPLC實驗參數。本實驗中采用HPLC體系中最常用的反相色譜柱Hypersil ODS（4.6mm×200mm，4.6μm），使用甲醇/水（80/20，v/v）為流動相，實驗溫度25℃，以20“L進樣，在波長517nm出檢測DPPH出峰。在空白溶液與樣品溶液之間DPPH峰面積（PA）的減少量被用來評價樣品的清除率。（1）

（2）DPPH標準曲線的繪制。準確稱取DPPH樣品0.01g，用甲醇溶液定容至10mL，濃度1g/L，作為儲備液，并將該溶液記作A溶液，甲醇溶液記作B溶液，去離子水溶液記作C溶液，梯度稀釋情況如表1。

以不同濃度標準溶液的主峰面積對其濃度作圖得到面積一濃度標準曲線圖1。

（3）樣品水溶液的清除效果。準確稱取各樣品0.01g，用去離子水定容至50mL，濃度0.2g/L，浸提2～3h，過濾后將該溶液記作A溶液；準確稱取DPPH0.01g，用甲醇溶液定容至10mL，濃度1g/L，作為儲備液，并將該溶液記作B溶液；將A、B兩種溶液以1：1的比例混合放入自動進樣器中，監測517nm波長下，3.8min時的主峰面積。

2.2.2 溫度對抗氧化劑活性的影響

各取一定量的樣品水溶液，于100℃水浴處理5min。分別取熱處理的和未經熱處理的各樣品，用分光光度法評價。

2.2.3 抗氧化劑在油劑中的穩定性

紡絲油劑主要由7%（w/w）的礦物油（包括表面活性劑等）和93%（w/w）的水組成，通過改變水相的成份，在絲束上油的過程中，將選定的自由基清除劑均勻的涂布到絲束表面。需要解決的問題包括活性添加劑在油劑體系和后序加工過程中活性的保持以及對油劑乳化穩定性的影響。準確稱量各樣品0.05g，用去離子水定容至50mL，濃度1g/L。并將該溶液記作A溶液。南通醋酸纖維有限公司提供的ST-90油劑記作B溶液。將A、B溶液以93：7（質量比）的比例混合放于離心管中，并在超聲波破碎儀下剪切5min，使油劑與抗氧化劑樣品充分混合，靜止放置，觀察其穩定性。

3 結果與討論

3.1 HPLC法評價結果

HPLC法評價結果見圖2。

根據各樣品反應后的主峰面積，及DPPH溶液空白的主峰面積，我們可以得到各樣品的清除率，可與分光光度法進行比較。

3.2 溫度對抗氧化劑活性影響的結果

溫度對抗氧化劑活性影響的結果見圖3。

由圖3可知，經過高溫熱處理后，各樣品的清除率與未經過熱處理樣品的清除率均沒有太大變化，茶多酚、茶黃素、紅茶和谷胱甘肽熱處理后的清除率均有所下降，大豆異黃酮和番茄紅素熱處理后的清除率均有所提高。由于變化不大，可基本忽略溫度對抗氧化劑的影響。

在后面的實驗中，應浸提后直接加入到油劑中，制成卷煙后用模擬吸煙設備吸煙時再考慮高溫處理后是否對各樣品的清除率有影響。

3.3 抗氧化劑在油劑中的穩定性結果

各樣品與油劑充分混合后，每天觀察其乳化效果，持續兩周，發現每個樣品的乳化性均很好，沒有出現分層的現象。說明加入抗氧化劑后對油劑的乳化性并沒有影響，在油劑中添加抗氧化劑可行。

4 結論

本論文研究了用于卷煙濾嘴的天然抗氧化劑活性的評價方法，同時驗證了多酚類、黃酮類等抗氧化劑清除自由基的能力，主要的研究結果如下。

（1）確定了適合于在實驗室進行的天然抗氧化劑的評價方法：HPLC法。

（2）分析得到了適于直接添加到卷煙濾嘴中的天然抗氧化劑，其清除效率均較好TP98%、TP35%（85%～95%）、SIF40%（64.77%）、SIF20%（73.02%）、GSH（77.09%）且顏色較淺。這五種抗氧化劑在清除穩定的自由基DPPH時都有較好的效果，由于時間關系，沒能做到將天然植物抗氧化劑添加到卷煙濾嘴中，實際評價其去除卷煙主流煙氣中自由基的效果。

（3）以水：油=93：7（質量比）的比例添加天然抗氧化劑，對油劑的乳化沒有影響。

（4）對樣品水溶液分析了溫度對其清除率的影響：經過高溫熱處理后，各樣品的清除率與未經過熱處理樣品的清除率均沒有太大變化，茶多酚、茶黃素、紅茶和谷胱甘肽熱處理后的清除率均有所下降，大豆異黃酮和番茄紅素熱處理后的清除率均有所提高。由于變化不大，可基本忽略溫度對抗氧化劑的影響。在后面的實驗中，應浸提后加到油劑中，制成卷煙后用模擬吸煙設備吸煙時再考慮高溫處理后是否對各樣品的清除率有影響。