涼血止癢合劑對變應性接觸性皮炎小鼠IL—10和IFN—γ表達的影響

楊瑾 楊雪松

摘要：目的 研究涼血止癢合劑對變應性接觸性皮炎小鼠IL-10和IFN-γ表達的影響。方法 通過涼血止癢合劑對采用2，4-二硝基氟苯（Dinitrofluobenzene 簡稱DNFB）造成變應性接觸性皮炎（Allergic contact dermatitis 簡稱ACD）小鼠耳廓腫脹模型的影響，觀察其對變應性接觸性皮炎小鼠炎癥細胞的抑制及對IL-10和IFN-γ表達的影響。結果 與模型組比較，涼血止癢合劑組能顯著抑制炎癥細胞浸潤和提高小鼠血清IL-10水平，差異具有統計學意義（P<0.05）；但是對IFN-γ的產生無明顯的影響（P>0.05）。結論 涼血止癢合劑對小鼠變態性接觸性皮炎有效，促進抗炎因子IL-10 的產生和表達可能是其治療機制之一。

關鍵詞：涼血止癢合劑；變應性接觸性皮炎；IL-10；IFN-γ；小鼠

中圖分類號：R285 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2016）06-0071-03

【Abstract】Objective： To study the effect of Blood-cooling Antipruritic Mixture on IL-10 and IFN-γ expression of allergic contact dermatitis mice. Methods： Blood-cooling Antipruritic Mixture was used to affect 2，4 Dinitrofluobenzene-induced allergic contact dermatitis（ACD）ear swelling mice model and to observe the inhibition of allergic contact dermatitis mouse inflammatory cells and its effect on IL-10 and IFN-γ expression. Results： Compared with the model group，the Blood-cooling Antipruritic Mixture group could significantly inhibit the inflammatory cell infiltration and improve serum IL-10 level in mice. The difference was statistically significant（P<0.05），but IFN-γ generation had no obvious effect（P>0.05）. Conclusion： Blood-cooling Antipruritic Mixture has effect on mice allergic contact dermatitis，and the generation and expression of promoting anti-inflammatory cytokine IL-10 may be one of its therapeutic mechanisms.

【Key words】Blood-cooling Antipruritic Mixture，allergic contact dermatitis，IL-10，IFN-γ，mice

涼血止癢合劑是在本院皮膚科全國第三批名老中醫學術經驗繼承工作指導老師、云南省名老中醫劉復興教授自創的皮內2號方—荊芩湯的基礎上研發的中草藥復方制劑（批號：滇藥制字〈Z〉20081880A號，由云南省中醫醫院制劑室生產）。該方主要由荊芥、黃芩、生地黃、牡丹皮、赤芍、紫草6味藥物組成，具有清熱涼血、祛風止癢之功，臨床主要用于治療中醫辨證屬血熱型的接觸性皮炎、化妝品皮炎、特應性皮炎、光敏性皮炎等各種皮炎、濕疹及蕁麻疹、藥疹等多種變態反應性皮膚病[1]。涼血止癢合劑臨床療效顯著，具有明顯抗炎止癢的作用，且無明顯毒副作用，然而其抗炎的作用機理，通過何種途徑發揮作用，都尚不明確。本研究通過建立2，4-二硝基氟苯（DNFB）所致的小鼠耳廓腫脹模型，觀察涼血止癢合劑對變應性接觸性皮炎小鼠炎癥細胞的抑制及對IL-10和IFN-γ表達的影響[2～3]，從組織病理及分子生物學方面闡述其作用機制，為其臨床應用提供一定的理論及實驗依據；同時通過急性毒性實驗，觀察涼血止癢合劑的毒副作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 昆明種小白鼠，清潔級，40只，雌雄各半，體重18-22 g，合格證號：SCXK（滇）2005-0008；合格證號：0013106，由昆明醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 藥物 涼血止癢合劑（批號：滇藥制字〈Z〉20081880A號），100mL/瓶，云南省中醫醫院院內制劑。醋酸地塞米松片（0.75mg/片，浙江仙琚制藥股份公司，國藥準字：H33020822，批號：130644）。0.9%氯化鈉注射液（國藥準字：H52020069，250mL/瓶，貴州天地藥業有限責任公司出品，批號A13061504）。

1.2 主要試劑及儀器 小鼠IFN-γ ELISA 檢測試劑盒、小鼠IL-10 ELISA 檢測試劑盒（深圳晶美生物有限公司提供）；2，4-二硝基氟苯（DNFB）：武漢福鑫化工有限公司，批號：201206012，分析純。顯微鏡、酶標儀，電子天平，電動剃毛器等。

1.3 給藥劑量

1.3.1 涼血止癢合劑劑量 涼血止癢合劑生藥含量為79 g/100mL，經人和動物的等效劑量系數換算，標準體重小鼠給藥劑量為20.57 g/kg。

1.3.2 醋酸地塞米松片給藥劑量[4] 小鼠給藥劑量為0.01 g/kg。

1.3.3 急性毒性實驗給藥劑量 涼血止癢合劑分別一次給藥劑量為200mg/kg。

1.3.4 主要試劑配制 以4∶[KG-*2]l的丙酮：橄欖油配成0.5%、0.2%兩種濃度，現用現配。

2 實驗方法

2.1 涼血止癢合劑對2，4-二硝基氟苯（DNFB）所致小鼠耳廓腫脹的影響

2.1.1 實驗動物分組、給藥與造模[4] 健康昆明種小鼠，30只，雌雄各半，隨機（隨機數字表法）分成3組，分別為模型組，陽性對照組（醋酸地塞米松組），涼血止癢合劑組。除模型組給予等體積生理鹽水外，陽性藥組醋酸地塞米松組每日給藥量為0.01 g體重[4]，按照人和動物的等效劑量系數計算，標準體重小鼠給藥劑量為20.57 g/kg，共給藥7d。實驗前一天在腹部固定部位3 cm×3 cm用剪刀及剃須刀去毛。實驗第1、2天致敏期于去毛部位涂0.5%DNFB，每天1次，每次20 μL，第3、4、5天不涂藥，第一次致敏后的第6天，用0.2%DNFB溶液20μl涂抹在小鼠左耳兩面進行免疫攻擊。右耳單涂丙酮∶橄欖油（4∶[KG-*2]1）溶劑作為對照；涂耳24 h后處死，沿耳廓基線剪下兩耳。

2.1.2 觀察指標

2.1.2.1 病理變化及炎癥細胞計數[5] 處死小鼠后，耳部皮損組織用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE 常規染色，光學顯微鏡下觀察各組病理變化，并用網型目鏡測微尺計數單位面積真皮層最密集炎細胞浸潤區的多形核細胞及單一核細胞數（個/mm2）。

2.1.2.2 檢測血清IL-10、IFN-γ水平[5] 實驗結束后，摘除小鼠眼球，眼眶內取血，抗凝血在4℃下3000 r/min離心30 min，獲取血漿，利用ELISA檢測血漿中IL-10、IFN-γ的濃度。

2.2 急性毒性試驗

2.2.1 目的 觀察涼血止癢合劑的毒副作用。

2.2.2 方法 取18～22 g小鼠20只，雌雄各半，分別一次給藥涼血止癢合劑200 mg/kg，觀察7d內動物死亡數，處死后解剖觀察臟器有無病變。

2.3 統計方法 使用SPSS18.0統計軟件。計量資料均使用（x±s）表示。兩獨立樣本的計量資料比較若呈正態分布，并具有總體方差齊性，則采用t檢驗，若不具有總體方差齊性，則使用t檢驗。2組以上數據比較若具有總體方差齊性則采用單因素方差分析，多組數據間的兩兩比較使用Least-Signfieant-diffrne（LSD）方法；2組以上數據比較若不具有總體方差齊性，則使用Kruskal-Wallis H秩和檢驗，兩兩比較使用Mann-Whitney U秩和檢驗。以上統計方法，均以P<0.05為具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 涼血止癢合劑對2，4-二硝基氟苯（DNFB）所致小鼠耳廓腫脹的影響，見表1，表2。

3.2 急性毒性試驗 對照組和涼血止癢合劑組小鼠均存活，肝臟解剖未見明顯異常，表明涼血止癢合劑無毒副作用，安全有效。

4 討論

在炎癥過程中產生的細胞因子可分為5類[1]：①調節淋巴細胞激活、增值、分化的細胞因子，如IL-2、IL-4、IL-10；②調節自然免疫的細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IFN-α；③激活巨噬細胞的細胞因子，包括IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-5、IL-10、IL-12；④對各種炎細胞的化學趨化因子；⑤刺激造血的細胞因子。其中IL-10是免疫反應的負調節因子，能減少LPS和IFN-γ誘導的單核/巨噬細胞釋放IL-6、IL-8、TNF-α等前炎性細胞因子，促進抗炎介質如可溶性TNFR的釋放，還可抑制CD4+T細胞的增值和細胞因子的分泌，包括Th1生成IL-2、IFN-γ和Th2生成IL-4、IL-5，同時還可抑制中性粒細胞合成和釋放促炎介質[6]。IFN-γ屬于激活巨噬細胞的細胞因子，可誘導加重炎癥[1]。

涼血止癢合劑和醋酸地塞米松連續灌胃給藥7天后，組織學檢查顯示涼血止癢合劑和地塞米松均可明顯抑制小鼠右耳中單—核細胞、中性粒細胞浸潤和充血水腫，2組與模型組比較有統計學差異（P<0.05），但涼血止癢合劑組和陽性對照組比較沒有統計學差異（P>0.05），說明涼血止癢合劑與醋酸地塞米松片均具有抗炎的作用，但涼血止癢合劑的抗炎作用并不優于醋酸地塞米松。

在細胞因子IL-10的研究中，與模型對照組比較，陽性藥地塞米松和涼血止癢合劑藥物均顯著提高具有免疫抑制活性細胞因子IL-10的產生水平，差異均有顯著性意義（P<0.05），但陽性對照組與涼血止癢合劑組比較，差異不顯著（P>0.05）；說明地塞米松和涼血止癢合劑均通過提高具有免疫抑制活性細胞因子IL-10的產生水平來達到抗炎的作用，但涼血止癢合劑并不優于醋酸地塞米松。對于IFN-γ的影響研究中，與模型對照組比較，陽性藥地塞米松組IFN-γ產生顯著減少，差異有顯著性意義（P<0.01），然而涼血止癢合劑對小鼠細胞因子IFN-γ產生無明顯的影響（P>0.05），說明地塞米松通過降低IFN-γ的水平，進而發揮抗炎癥作用，但涼血止癢合劑對IFN-γ水平的影響不顯著。

通過急性毒性試驗，對照組和涼血止癢合劑組小鼠均存活，肝臟解剖未見明顯異常，表明涼血止癢合劑無毒副作用，安全有效。

涼血止癢合劑臨床應用已十多年，并在云南中醫醫療集團20余家醫院廣泛使用，臨床療效顯著，具有明顯抗炎止癢的作用，且無明顯毒副作用。現代藥理學研究證明其組方中的黃芩、丹皮、赤芍、紫草、荊芥均有一定的抗炎作用，對I、II、III和Ⅳ變態反應均有抑制作用，對白介素、IFN-γ等細胞因子的表達水平均有影響[7～8]，為組方的合理性提供了一定現代藥理學依據，但中藥復方通常作用于機體多靶點、多環節，是個復雜系統，故有必要進一步深入研究，闡明其抗炎的作用機制，并通過急性毒性試驗從科學角度驗證其毒副作用。

通過以上的研究表明，涼血止癢合劑具有較為明確的抗炎作用，其抗炎作用可能與提高細胞因子IL-10的產生水平有關，且無毒副作用，安全有效。不僅為其它變態反應參與的皮膚病的防治開拓新的思路，同時為名老中醫臨床經驗的應用推廣提供了科學依據，為進一步挖掘及研究名老中醫學術思想和臨床經驗提供了新的思路。

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（收稿日期：2016-03-28）