小麥紋枯病菌拮抗菌株X2—3的鑒定及其抗菌特性分析

湯谷月 劉朝霞 趙寶梅 劉春菊 韓超

摘 要：從小麥根際土中分離到一株對小麥紋枯病菌拮抗活性較高的菌株X2-3，為進一步利用該菌株，對其進行了鑒定，并對其抗菌特性進行了分析。根據菌落形態和產酶特征及16S rDNA分析，將菌株X2-3鑒定為辣椒溶桿菌（Lysobacter capsici）。平板對峙法測定其抑菌譜發現，X2-3對Rhizoctonia cerealis、Thielaviopsis basicola等多種植物病原真菌和Phytophthora parasitica等卵菌表現明顯的抑菌活性，但對Xanthomonas oryzae pv. oryzae和Ralstonia solanacearum等革蘭氏陰性細菌沒有拮抗活性。抗菌物質穩定性分析結果發現，粗提純的抗菌物對蛋白酶K和溫度不敏感，表明該物質可能屬于非線性蛋白，且具有一定的耐熱性。

關鍵詞：辣椒溶桿菌； 鑒定； 抗菌物質； 拮抗活性

中圖分類號：S482.2+92文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）05-0093-05

Abstract A strain X2-3 that showed higher antifungal activity to Rhizoctonia cerealis was isolated from wheat rhizosphere soil. Then it was identified and its antifungal characteristics were analyzed for further utilization. The strain X2-3 was identified as Lysobacter capsici based on the cultural properties and 16S rDNA sequence. Antimicrobial spectrum analysis indicated that X2-3 showed obvious antimicrobial activities to plant pathogenic fungi Rhizoctonia cerealis， Thielaviopsis basicola and oomycetes Phytophthora parasitica， but not to gram-negative bacteria such as Xanthomonas oryzae pv. oryzae and Ralstonia solanacearum. The stability analysis results showed that the antimicrobial substance crudely purified from strain X2-3 were not sensitive to protease K and high temperature， which indicated that it might be nonlinear protein and had certain heat resistance.

Key words Lysobacter capsici；Identification； Antifungal substance； Antimicrobial activity

溶桿菌屬（Lysobacter）在自然環境中多見于土壤和水體等，由于該類細菌生長較慢，與芽孢桿菌、假單孢桿菌等細菌相比，其分離純化較為困難，分離出現的比例相對較低[1]。溶桿菌為革蘭氏陰性菌，菌體桿狀，無鞭毛，可滑行，基因組G+C含量較高，在NA培養基菌落乳白色或淡黃色，圓形，表面光滑。目前已知的溶桿菌有20個種，包括產酶溶桿菌（Lysobacter enzymogenes）、抗生素溶桿菌（L. antibioticus）和膠狀溶桿菌（L. gummosus）等[2]。溶桿菌屬因具有如下特性而備受關注：（1）溶桿菌可產生蛋白酶、幾丁質酶和纖維素酶等多種胞外酶，這些酶類對多種病原真菌、細菌和線蟲具有溶菌活性；（2）可產生β-內酰胺類、大環肽類和縮肽類等多種抗生素，在抗生素的研制和開發中有重要價值[3]。溶桿菌在植物病害防治中已有一些研究和報道，其中研究較多的為L. enzymogenes，研究發現，L. enzymogenes菌株C3對小麥赤霉病、高羊茅葉斑病和菜豆銹病等都有較好的防治效果[4，5]。

紋枯病是小麥的重要病害之一，由于該病的病原菌主要存在于病田土壤，藥劑防治較為困難，利用土壤有益微生物防治該類病害是有效的措施之一。本研究從小麥根際土壤中分離到一株對紋枯病菌表現較強抑菌活性的菌株，經16S rDNA序列比對，結合培養特征等，對菌株X2-3進行了鑒定，并對其產生的抗菌物質的穩定性進行了分析，為進一步利用該菌株提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株材料：菌株X2-3參照韓超等[6]的方法從小麥根際土壤中篩選獲得。用于抗菌作用測定的病原菌包括小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、小麥紋枯病菌 （Rhizoctonia cerealis）、煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica）和群結腐霉（Pythium myriotylum）等，所用菌株詳細見表1。所用供試病原菌均由山東農業大學分子植物病理學實驗室提供。

培養基： 細菌篩選、培養用NA培養基；細菌抗菌物質產生及分析用LB培養基；真菌培養及抗菌作用分析用PDA培養基。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 菌落形態觀察：將篩選出的菌株X2-3劃線于NA培養基，28℃培養48 h，觀察菌落特征，包括菌落形態、大小、顏色等。

產酶特性分析：以NA為基礎培養基，以0.1%（W/V）昆布多糖替代葡萄糖為唯一碳源，分析該菌株是否具有產葡聚糖酶的能力；蛋白酶分析以終濃度為1%（W/V）的脫脂奶粉代替蛋白胨，分析該菌株是否具有產蛋白酶的能力。將在NA培養基上培養好的X2-3菌體稀釋至OD600為0.5，取10 μL滴于測試用培養基平板，28℃培養3 d，觀察透明圈有無及大小，分析是否具有產酶能力。

分子鑒定：菌株X2-3在LB培養基28℃下振蕩培養至對數生長期，8 000 r/min離心收集菌體。參照Rainey等（1996）[7]的方法提取基因組DNA。用16S rDNA通用引物（27F： AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R： GGTTACCTTGTTACGACTT）進行PCR擴增[8]。PCR反應體系（25 μL）：Taq酶（ 5 U/μL） 0.5 μL，dNTPs （2.5 mmol/L） 2.0 μL，10 ×Buffer （Mg2+） 2.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，最后補足17.0 μL雙蒸水。PCR反應條件參照韓超等[6]的方法。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用膠回收試劑盒回收目的片段，送上海生工測序。將所測16S rDNA序列用BLAST軟件與GenBank數據庫進行相似性比對，用分析軟件DNAMAN v5.2.2進行序列同源性分析。

1.2.2 X2-3的抑菌活性測定 以表1病原菌作為供試菌進行抑菌活性測定。菌株X2-3在NA培養基培養 2 d，用無菌水稀釋至OD600為0.5，取15 μL菌液滴于PDA或NA平板的中心位置（抗真菌或卵菌分析用PDA培養基，抗細菌分析用NA培養基），于28℃培養2 d，備用。

用直徑5 mm打孔器從培養的真菌和卵菌的菌落邊緣打取菌落圓片，移至PDA培養基，距X2-3菌落約3 cm。28℃繼續培養2～5 d，觀察記錄抑菌圈大小，根據抑菌圈大小判斷該菌株的拮抗效果。

對細菌的抑菌能力采用平板噴霧法測定，把培養好的Xanthomonas oryzae pv. oryzae和Ralstonia solanacearum分別制成1×108 cfu/g左右的孢子懸浮液，用無菌微量噴霧器均勻噴在X2-3菌落周圍，28℃繼續培養2 d，觀察記錄抑菌圈有無及大小。

1.2.3 抗菌物質穩定性測定 菌株X2-3在LB培養液經28℃、180 r/min培養72 h，于10 000 r/min、4℃離心20 min，重復2次，得到無菌濾液。參照任嘉紅等[9]的方法，將1 L無菌濾液經硫酸銨沉淀、甲醇萃取、旋轉蒸發等處理后，共得到0.3 g 粗提物，用無菌水將粗提物配置成濃度約250 mg/mL，備用。

以立枯絲核菌為指示菌，采用瓊脂孔擴散對峙法，測定X2-3粗提物對溫度和蛋白酶K的穩定性。

熱穩定性測定：將粗提液用1.5 mL離心管分裝，分別在40、50、60、70、80、90℃和100℃等溫度下處理30 min，備用。將直徑 5 mm的立枯絲核菌菌絲塊移至PDA平板中央，并在距菌絲塊約2 cm處分別打孔，每孔加入30 μL上述粗提液，以室溫（25℃）保存的未經加熱處理的粗提液為對照，每處理重復3次。28℃培養2 d，測量記錄抑菌圈大小，分析抑菌效果。

蛋白酶K穩定性測定：取0.5 mL粗提液，加入蛋白酶K溶液使其終濃度為0.1 mg/mL，充分混勻后，置37℃水浴鍋中溫育2 h使其充分反應，以未加蛋白酶K處理為對照。參照上述方法測定抑菌活性，每處理重復3次。

2 結果與分析

2.1 菌株X2-3的培養特征

菌落形態特征：菌株X2-3在NA培養基培養48 h形成圓形菌落，乳白色至淡黃色、不透明、有光澤、不產生熒光，表面光滑、無褶皺、邊緣整齊，菌落粘稠，流動性強（圖1a）。

產酶特性：圖1b和1c分別是X2-3在以昆布多糖為唯一碳源和脫脂奶粉為氮源的培養基上的培養特征。可見，X2-3在昆布多糖和脫脂奶粉培養基上28℃培養3 d，在菌落周圍都可產生明顯的透明圈，表明該菌株具有β-1，3-葡聚糖酶和蛋白酶產生能力，顯示菌株X2-3具有溶桿菌的培養特征。

2.2 菌株X2-3的分子鑒定

對菌株X2-3的DNA進一步用細菌16S rDNA進行PCR擴增，在1 400 bp左右擴增出一條單一條帶。對擴增片段進行了序列測定，對所測序列在NCBI數據庫中與已報道的細菌16S rDNA進行BLAST比較，并用MEGA 5.0軟件分析系統進化關系（圖2）。結果顯示，菌株X2-3與已報道的辣椒溶桿菌（Lysobacter capsici）菌株AZ78（基因登錄號KF196834）和YC5194（基因登錄號NR044250）親緣關系最近，相似性在99.8%，分在同一分支，進一步確定該菌株為Lysobacter capsici（X2-3基因登錄號為KP978015）。

2.3 菌株X2-3抗菌活性分析

利用平板對峙法，分析了菌株X2-3對10種病原菌的抑制作用，結果見表1。從表1可見，X2-3對R. cerealis、Thielaviopsis basicola、B. sorokiniana等植物病原真菌和P. parasitica、P. myriotylum等植物病原卵菌均表現較強的抑菌效果，其中，以對R. cerealis、T. basicola和B. sorokiniana抑菌效果最好，抑菌圈半徑均在10 mm以上，對R. solani和P. myriotylum效果較差，抑菌圈直徑大約在7～8 mm之間；對X. oryzae pv. oryzae和R. solanacearum等革蘭氏陰性細菌沒有抑菌作用。部分抑菌效果見圖3。

2.4 菌株X2-3抗菌物質穩定性分析

以立枯絲核菌為指示菌，分析了X2-3粗提物對蛋白酶K和溫度的敏感性。圖4A是不同溫度處理后粗提物的抗菌活性，可見，粗提物在不同溫度下處理30 min，其抗菌活性差異明顯。隨處理溫度的升高，抑菌圈直徑越來越小，即抗菌活性越來越小，其中40℃處理后其抗菌活性與對照幾乎沒有差異，50～80℃處理，粗提物仍有較好的抑菌作用，相互間差異不顯著， 90～100℃時活性雖顯著降低，但仍有部分抑菌活性，表明該物質對溫度有一定忍耐力。

蛋白酶K 是一種作用廣譜的蛋白酶，能夠以線性蛋白為底物降解多種蛋白質。X2-3粗提物經蛋白酶K處理2 h，其抗菌活性與對照幾乎沒有差異（圖4B），說明該物質對蛋白酶K不敏感，可能不屬于線性蛋白。

3 結論與討論

植物根際微生物群體存在多樣性，它們在植物病害防治、促進植物生長等方面發揮了重要作用。溶桿菌作為其中的重要類群之一，也顯示多種生物功能。據Christensen和Cook報道，溶桿菌對真菌、革蘭氏陰性和陽性細菌及病原線蟲都有一定的拮抗作用[10]。目前關于溶桿菌的研究多集中于產酶溶桿菌[3，11]，對其它種類溶桿菌的研究相對較少。本研究通過培養特征及分子生物學分析，將分離自小麥根際土的菌株X2-3鑒定為辣椒溶桿菌（Lysobacter capsici）。通過抗菌作用分析，發現該菌株對多種真菌、卵菌有較強的抑菌活性，但對革蘭氏陰性植物病原細菌沒有拮抗活性。

許多研究表明，溶桿菌可通過分泌胞外酶、產生表面活性物質和抗生素等多種機制，破壞病原物的細胞結構或抑制病原物生長[2]。研究發現，L. enzymogenes可產生不止一種抗菌物質，據Lou等報道，L. enzymogenes菌株OH11和C3都可產生大環內酰胺類抗真菌成分，該成分具有抗菌譜廣和熱穩定等特征[12]。本研究初步分析發現，辣椒溶桿菌X2-3產生的抗真菌物質也具有耐熱性，并且對蛋白酶K不敏感，表明該抗菌物質可能是一種環形肽，但與L. enzymogenes產生的抗菌物質在結構上是否有相同之處，有待進一步研究。

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